白藜芦醇调控Treg/Th17 抑制溃疡性结肠炎肠道黏膜炎症的实验研究

顾秋平，朱方擎，刘金金，谢俊锋，汤建华

赣州市人民医院，江西 赣州 341000

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病的一种类型［1］，发病人数逐年增多，其发病表现为炎症反应持续时间长，病情反复，不易医治。截至目前，UC 的成因以及发病机制还在研究当中，有研究显示，它的发生可能和遗传以及肠道黏膜免疫反应有一定的关联［2］。白藜芦醇存在于自然界很多植物中，属于酚类化合物，具有抑制炎症、抗肿瘤等功效，与此同时，还能保护机体的重要脏器［3-4］。本研究通过建立UC 模型小鼠，研究调节性T 细胞（Treg）/辅助性T 细胞17（Th17）在白藜芦醇治疗UC 中的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级C57BL/6 小鼠50 只，8 周龄，雌雄各半，体质量20～25 g，购于广东省医学动物实验中心，饲养于赣州市人民医院屏障级动物房，12 h 光照和黑暗循环，室内温度22±2℃，湿度45%～55%。

1.2 主要试剂与仪器

白藜芦醇（含量≥98%，上海源叶公司）；PBS 缓冲液（上海索莱宝公司）；莫能霉素（武汉欣欣佳丽公司）；白细胞介素17（IL-17）ELISA试剂盒（北京中检公司）；白细胞介素23（IL-23）ELISA 试剂盒（北京中检公司）；FBS（上海慧颖公司）；流式细胞仪（型号：Callibur Ⅱ，美国Becton Dickinson 公司）；台式高速冷冻离心机（型号：TGL-16，湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 实验方法

将小鼠随机分为5 组，每组10 只。阴性对照组饮用纯化水，模型对照组、阳性对照组与白藜芦醇（Res）组饮用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）7 d建立UC 模型。造模完成后，阴性对照组与模型对照组每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）0.2 mL；Res 低剂量组每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的8 mg/mL 的Res 0.2 mL；Res 高剂量组每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的Res 0.2 mL；阳性对照组每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的柳氮磺吡啶栓（SASP）0.2 mL，5 组均连续给药14 d。采用眼眶采血法采集小鼠外周血，离心分离得血清进行ELISA 检测；颈椎脱臼法处死小鼠，分离肠道黏膜组织，提取淋巴细胞进行测定，按照ELISA 试剂盒检测肠道黏膜组织IL-17 和IL-23 水平。

淋巴细胞提取方法：将肠黏膜组织放入细胞筛网内，加入PBS 后研磨组织，收集单细胞悬液，500 g、4 ℃离心5 min，重悬单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL。随后加入莫能霉素，250 g 离心10 min，弃上清液，用含5% 胎牛血清（FBS）的PBS重悬，洗涤细胞两次，收集细胞。

1.4 观察指标

（1）比较各组小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴细胞的占比以及Treg/Th17 比值。（2）各组肠道黏膜组织IL-17 和IL-23 的表达。（3）比较各组小鼠外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 肠道黏膜T 细胞亚群水平

各组Treg、Th17 以及Treg/Th17 均有差异（F=128.160、117.756、79.115，P<0.001）。与阴性对照组比较，模型对照组小鼠Treg 细胞占比、Treg/Th17 下调，Th17 细胞占比上调，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组比较，Res 低剂量组、Res 高剂量组以及阳性对照组Treg 细胞占比、Treg/Th17 上调，Th17 细胞占比下调，差异有统计学意义（P<0.05）。与Res 低剂量相比，Res 高剂量组以及阳性对照组Treg 细胞占比、Treg/Th17 上调，Th17 细胞占比下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肠道黏膜T细胞亚群水平比较（）

表1 各组小鼠肠道黏膜T细胞亚群水平比较（）

注：与阴性对照组比较，aP<0.05，与模型对照组比较，bP<0.05，与Res低剂量组比较，cP<0.05。

2.2 黏膜组织IL-17 以及IL-23 的表达

各组肠道黏膜IL-17、IL-23 表达差异有统计学意义（F=158.901、128.330，P<0.001）。与阴性对照组比较，模型对照组IL-17、IL-23 上调，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组比较，Res 低剂量组、Res 高剂量组以及阳性对照组IL-17、IL-23 下调，差异有统计学意义（P<0.05）。与Res 低剂量相比，Res 高剂量组以及阳性对照组IL-17、IL-23 下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组小鼠IL-17以及IL-23的表达（pg/mg，）

表2 各组小鼠IL-17以及IL-23的表达（pg/mg，）

注：与阴性对照组比较，aP<0.05，与模型对照组比较，bP<0.05，与Res低剂量组比较，cP<0.05。

2.3 小鼠外周血炎症因子的表达

各组外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 表达均存在 差 异（F=224.912、84.953、77.228，P<0.001）。与阴性对照组比较，模型对照组IL-1β、IL-6 和TNF-α 上调，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组比较，Res 低剂量组、Res 高剂量组以及阳性对照组IL-1β、IL-6 和TNF-α 下调，差异有统计学意义（P<0.05）。与Res 低剂量相比，Res高剂量组以及阳性对照组IL-1β、IL-6 和TNF-α下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 各组小鼠外周血炎症因子的表达（nmol/L，）

表3 各组小鼠外周血炎症因子的表达（nmol/L，）

注：与阴性对照组比较，aP<0.05，与模型对照组比较，bP<0.05，与Res低剂量组比较，cP<0.05。

3 讨论

相关研究显示，Th17、Treg 细胞参与了UC 的发病，与之有着不容忽视的关联［5-6］。Th17 细胞能够生成IL-17，并将之分泌到细胞外，参与到炎症反应。在炎性肠病的发展当中，IL-17 能够联合IL-23 加重炎症反应。Treg 细胞的功能便是负性调节机体的炎症反应，另外，它还参与了外周免疫耐受的产生、免疫平衡的稳定，对维持机体稳态意义重大。本实验结果，模型对照组小鼠肠黏膜组织中的Treg 细胞占比在下调，Th17 细胞则在上调，且Treg/Th17 也在下调，说明模型对照组小鼠体内存在Treg 和Th17 比例失衡。进一步检测IL-17 以及IL-23 水平，发现模型对照组IL-17 和IL-23 水平的确存在上调，进一步印证了Treg 和Th17 比例的失衡。

各种细胞因子在UC 的发生与发展中也会起到一定的作用［7］，这些细胞因子主要由免疫细胞产生，有连结各免疫细胞功能的作用，使得免疫功能更加迅速与稳定；另外，细胞还能通过分泌到细胞外，导致机体发生炎症反应。促炎性细胞因子［8］（IL-1、IL-6 和TNF-α 等）被认为与UC 的发生关联重大。在UC 发生时，这些促炎因子能导致中性粒细胞以及巨噬细胞等免疫细胞数量大量增长，进一步分泌更多促炎因子来加重自身炎症反应，UC 的发作也变得严重又漫长，对肠黏膜组织造成严重伤害。本实验结果，模型对照组小鼠促炎性细胞因子释放增加，说明UC 小鼠机体炎症作用很剧烈，UC 会导致促炎因子大量释放。

白藜芦醇属于多酚类物质，其主要在抗氧化，抗炎以及抗肿瘤等方面发挥作用［9］。目前很多研究中，白藜芦醇也参与到了UC 预防和治疗当中［10］。也有临床研究显示，口服白藜芦醇能够显著降低UC 患者肠道炎症反应，改善患者的临床病症。在UC 动物实验中，白藜芦醇能降低UC 小鼠的氧化应激并且能下调促炎因子的表达。本实验结果，在使用了白藜芦醇干预后，Treg 细胞百分比上升，Th17细胞百分比下降，Treg/Th17 比值上升，在向正常小鼠接近，IL-17 以及IL-23 的表达也在降低。检测炎症因子的表达发现IL-1β、IL-6 和TNF-α 均下降，且高剂量的白藜芦醇对上述指标的改善作用更加明显。说明白藜芦醇能通过调控Treg/Th17 免疫平衡来降低炎症因子的表达，减轻炎症反应，并且高剂量作用效果更佳。