尿毒清颗粒微生物限度检查方法适用性研究及质量评价

卜红宇，高瑞霞，滕赟，张茜，周刚

内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010020

尿毒清颗粒主要是由黄芪、大黄、白术、桑白皮、茯苓、丹参、川芎等组成，主要用于慢性肾功能衰竭氮质血症以及尿毒症，执行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-229（Z-033）-2000（Z）。查阅文献，关于尿毒清颗粒的研究主要集中在治疗慢性肾功能衰竭及早期糖尿病肾病的临床研究方面［1-4］，未见关于尿毒清颗粒微生物限度检查的报道。为了控制药物质量，本实验按照《中国药典》2015 年版四部通则［5］对尿毒清颗粒微生物限度检查法进行方法适用性研究，在此基础上评价了84 批尿毒清颗粒的微生物污染情况，为全面评价尿毒清颗粒质量提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

样品与培养基：84 批尿毒清颗粒（来源：国家药品抽检，规格：5 g/袋，处方一致），蛋白胨水、胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖液体、沙氏葡萄糖琼脂、胰酪大豆胨液体、麦康凯琼脂、麦康凯液体；以上培养基均为美国BD 公司生产。

菌种：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］（中国食品药品检定研究院提供）。

仪器：AC2-4SI 型生物安全柜（Esco Micro Pte有限公司），PL602-S 型电子天平（梅特勒-托利多集团），MIR-554 型培养箱（日本三洋公司），高压蒸汽灭菌柜（Getinge Sterilization 有限公司），超低温保存箱（海尔集团），Easy MIX 型均质器（生物梅里埃法国股份有限公司），移液器（Eppendorf生命科学公司）。

1.2 菌液制备

取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌及白色念珠菌的新鲜培养物，制成5 000～10 000 CFU/mL 的菌悬液。取培养5～7 d的黑曲霉培养物，将孢子洗脱，制成5 000～10 000 CFU/mL 的孢子悬液。

1.3 供试液制备

取供试品10 g，置于无菌均质袋中，加100 mL的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，用均质器拍打1 min，摇匀，作为1∶10 的供试液。

1.4 需氧菌总数、霉菌及酵母菌适用性试验

采用平皿法验证供试品有无抑菌性：取1∶10供试液9.9 mL 和0.1 mL 试验菌混匀，取1 mL 注皿，平行制备2 个平皿。回收率测定：回收率=（试验组平均菌落数-供试品组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%；回收率应该在50%～ 200%范围内。试验组为9.9 mL 供试液加入0.1 mL 试验菌；菌液组为9.9 mL 不含中和剂及灭活剂的稀释液加入0.1 mL 试验菌；供试品组为9.9 mL 供试液加入0.1 mL 稀释液。

1.5 控制菌检查方法适用性试验

采用常规法验证供试品有无抑菌性：大肠埃希菌试验组为取1∶10 供试液10 mL 及不大于100 CFU 的大肠埃希菌加入100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中；依控制菌检查法，在规定的温度和最短的时间下培养，应能检出所加试验菌的反应特征。

2 结果

2.1 微生物检查法适用性试验结果

从表1 中可以看出，供试品铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均在50%～200%，说明可采用1∶10 平皿法检测需氧菌总数、霉菌和酵母菌。从表2 中可以看出，试验组检出大肠埃希菌的反应特征，表明本品在该条件下对大肠埃希菌的抑制作用可以忽略不计，可采用常规法进行本品的大肠埃希菌检查。

表1 需氧菌总数、霉菌及酵母菌适用性试验

表2 大肠埃希菌试验结果

2.2 84 批样品微生物限度检查结果

本实验采用“2.1”中建立的微生物检查法对84 批尿毒清的微生物指标进行检测，结果见表3。对84 批供试品需氧菌计数结果统计分析，尿毒清颗粒需氧菌总数X<10 有55 批，约占65.5%；10 ≤X<101有17 批，约占20.2%；101≤X<102有11 批，约占13.1%；X>102有1 批，约占1.2%；需氧菌总数均未超过103CFU/g，合格率为100%。对尿毒清颗粒霉菌及酵母菌统计分析发现，霉菌及酵母菌总数X<10 有71 批，约占84.5%；10 ≤X<101有7 批，约占8.3%；101≤X<102有6 批，约占7.1%；霉菌及酵母菌总数均未超过102CFU/g，合格率为100%。84 批尿毒清颗粒均未检出大肠埃希菌。

表3 84批尿毒清颗粒微生物限度检查结果

3 讨论

尿毒清颗粒的微生物限度按照《中国药典》2015 年版四部通则1107 要求，需氧菌总数不得过103CFU/g；霉菌和酵母菌数不得过102CFU/g；不得检出大肠埃希菌（1 g）。本研究中，84 批供试品均符合《中国药典》要求，整体质量较稳定，但供试品的需氧菌、霉菌及酵母菌总数仍存在较大差异，这说明该产品卫生质量存在一定问题。提示生产企业加强微生物污染的监测控制，规范生产。

中药材易受微生物的污染，细菌、放线菌和真菌是污染中药材常见的微生物，致病真菌的污染最严重［6-7］。微生物污染是药品质量评估的重要指标［8］，微生物在自然界分布广泛，微生物污染的来源和途径很多［9-11］，包括药材原料的种植、晾晒、收集、储藏等，也包括制剂生产商的各个生产环节，如生产环境、设备、原料、人员等各方面。建议生产商推进微生物过程控制理念的实施，建立过程管理控制程序［12］，在整个生产过程中监测控制微生物的污染，使微生物负载降至最低。另外，生产商也应该监测产品在存放过程中微生物的影响因素及变化规律，以确保产品在有效期内不会受到微生物污染。

本实验建立了尿毒清颗粒的微生物检查方法，采用1∶10 平皿法检查需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数；采用常规法检查大肠埃希菌。检测了84 批尿毒清颗粒的微生物限度指标，合格率100%，尿毒清颗粒的卫生质量相对稳定。