聚糖标志物在辅助预测房颤消融术后复发中的应用*

刘雨辰，陆文江，陈 楚，史嘉玉，苏忆玲，陆 齐

(南通大学附属医院心血管内科，南通 226001)

心房颤动(简称房颤)是临床上最常见的心律失常的一种类型，是心血管相关领域的两大堡垒性疾病之一，因其会造成较高的致残率和死亡率而备受关注。房颤会导致许多严重的并发症，如心力衰竭、血栓栓塞、脑卒中、心原性休克等，尤其是脑卒中发生的风险要比一般人高5 倍。近年来导管消融治疗在维持窦性心律和持续改善患者生活质量等方面表现出色，越来越多的患者选择其作为治疗方案[1]。准确的术后复发预测成为选择合适治疗方案的关键。目前尚缺乏对其术后复发预测的相关指标。

免疫球蛋白(immunoglobulin G,IgG)是血清主要的抗体成分，糖基化是IgG 最常见的蛋白翻译后修饰形式，IgG 糖基化的改变可以调节体内各种炎症反应并影响多种炎症相关疾病的进展。IgG 聚糖构象的微小变化与人类多种自身免疫性疾病相关，如癌症[2]、糖尿病[3]、获得性免疫缺陷综合征[4]和卒中[5]等。因其聚糖具有可变性和对生理变化的先天敏感性等特质，故可成为一种具有诊断性和预测性的生物标志物。众所周知，房颤也是一个炎症反应的过程，在房颤发生和持续时会释放大量的炎症因子[6-7]，故推测在房颤患者的血清中IgG 可能存在异常聚糖结构的改变。

本研究量化了来自房颤患者及在年龄和性别匹配后的对照组患者的血浆IgG N-连接聚糖，并检验了个体聚糖(GP1～GP24)的差异，旨在确定房颤潜在的糖类生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016 年9 月—2020 年3 月在南通大学附属医院心血管内科诊断为阵发性房颤并行环肺静脉消融术患者192 例，术后常规服用胺碘酮及抗凝药(华法令、利伐沙班、达比加群等)3 个月，具体治疗方案由主治医师决定。房颤诊断标准参照2019年AHA/ACC/HRS 美国房颤管理指南：体表十二导联心电图或24 h 动态心电图中对房颤的描述：(1)窦性P 波消失，出现无规律的心房波，f 波频率在350～600 次/min；(2)出现无规律的QRS 波群，RR 间期绝对不齐。若患者满足以上2 点，则诊断为房颤。阵发性房颤的定义则是持续时间≤7 d(常≤48 h)，能自行终止，反复发作。排除失访及死亡患者31 例。纳入的病例分为复发组和未复发组。术后复发标准：术后3 个月后患者出现房颤、房扑、房速≥30 s，且被心电图或动态心电图证实。选择同一时期行房颤消融术，术后未复发患者为对照组，均符合阵发性房颤标准，排除标准：患有免疫性疾病、确诊恶性肿瘤、肾功能不全、糖尿病者。因糖基化具有雌激素及年龄依赖性[8-9]，因此排除<45 岁患者及未绝经女性以减少误差。本研究方案经南通大学附属医院医学伦理委员会批准，并获得所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 随访数据收集 从术前开始入组随访，采用电话咨询及门诊复查心电图进行随访，随访时间为术后1、3、6、9、12 个月。房颤的诊断标准为患者的随访时心电图或24 h 动态心电图。

1.2.2 IgG 糖基化分析

1.2.2.1 血液的收集 所有调查对象于清晨空腹8～12 h，抽取静脉血6 mL，血标本编号与调查问卷上的研究序列号相对应。全血标本采集后1 h 内离心(3 500 r/min,15 min)，吸出血清分装置于-80 ℃冰箱，储存至分析时间≤1 年。

1.2.2.2 IgG 的纯化 采用96 孔Protein G 纯化板[博格隆(上海)生物技术有限公司]亲和层析的方法纯化血清中的IgG。用4 倍柱体积的结合缓冲溶液(20 mmol/L 磷酸钠溶液,pH 9.0)平衡96 孔蛋白G纯化板2 次，加入70 μL 血清与100 μL 结合缓冲液的混合溶液，室温孵育45 min。离心去除过柱的废液，再用5 倍柱体积的结合缓冲液洗脱3 次去除未结合的蛋白。用2 倍柱体积的淋洗溶液(0.1 mol/L 甘氨酸溶液,pH 7.0)将IgG 洗脱到预先加入10 μL Tris-HCL 溶液的96 孔收集板中。采用BCA 试剂盒(Thermo fisher scientific 公司)检测每个收集的样品以确定收集液中IgG 的含量。

1.2.2.3 糖链的游离与纯化 将糖苷酶(PNGaseF)(New England Biolabs 公司)工作溶液加入纯化的IgG样品溶液中，10 μL/孔，混匀后37 ℃过夜孵育。孵育结束后，将样品加入到预先活化、平衡过的石墨化碳96 孔纯化板(Grace 公司)孔中，反复上样3 次后超纯水洗2 次以去除盐分与杂质。然后用含0.05%(v/v)的三氟醋酸的25%(v/v)乙腈水溶液洗脱并收集糖链后真空浓缩至干。

1.2.2.4 糖链的荧光标记 将20 mg 2-氨基苯甲酰胺完全溶解于400 μL 二甲基亚砜和冰乙酸的混合液(体积比7∶3)，然后将24 mg 氰基硼氢化钠溶解于以上溶液，即为荧光标记溶液。每份糖链加入3 μL标记溶液后振荡，60 ℃孵育2 h。孵育结束后，每份标记液中加入50 μL 超纯水混匀过0.22 μm 膜后待荧光标记-超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)分析。

1.2.2.5 标记糖链的UPLC 分析 标记后的糖链样品采用配有四元泵，荧光检测器的Waters Acquity UPLC 进行分离检测。色谱参数为：超高效液相系统：Waters H-Class UPLC；色谱柱：ACQUITY UPLC○R BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm Column；荧光检测器：λex=330 nm，λem=420 nm；柱温：60 ℃；自动进样器温度：2～8 ℃；进样体积：2 μL；流动相：A，100 mmol/L 甲酸铵(pH 4.50±0.05)，B，100%乙腈；梯度见表1。数据处理采用传统集成算法的自动处理方法并进行手动校正。所有色谱图都按统一标准分成24 组峰，每组峰百分含量=该峰面积/24 组峰总峰面积×100%。

表1 色谱梯度参数

1.2.3 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件对数据进行分析。计量资料均先行正态性检验，符合正态分布的以表示，两组间比较采用两独立样本t 检验；非正态分布的以中位数及四分位数表示，两组间比较采用两独立样本的非参数检验；率之间比较采用χ2检验。采用多变量Logistic 回归分析确定24 种聚糖结构与复发之间的相关性。危险因素筛选采用逐步向前法。对每个聚糖结构单独进行受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析，以验证其灵敏度和预测能力。所有的计学检验均采用双尾P 值，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者的一般资料及GP1～GP24 比较 共192 例房颤患者符合入选标准，其中31 例患者因失访等各种原因被排除，最终共计161 患者纳入统计分析。其中复发患者81 例，未复发患者80 例，两组患者的基线资料及GP1～GP24 比值比较见表2～3，色谱图见图1。

优化结构布局，改善设施条件：2020年末，全省农村社会福利服务中心100%符合《养老机构服务质量基本规范》的基本要求，床位利用率达到70%以上，委托社会力量运营管理的达到40%以上。

图1 两组患者的色谱图

表2 复发组与未复发组的基线资料比较(n,%,M,P25,P75)

表3 复发组与未复发组的GP1～GP24 比较(M,P25,P75,)

表3 复发组与未复发组的GP1～GP24 比较(M,P25,P75,)

2.2 聚糖单因素逻辑回归分析 对GP1～GP24 进行单因素分析，结果提示GP3b、GP4、GP5、GP6、GP8b、GP14、GP15、GP16a、GP16b、GP17、GP18a、GP18b、GP19、GP22、GP23 与房颤术后复发风险有关(表4)。

表4 GP1～GP24 单因素逻辑分析

2.3 聚糖多因素逻辑回归分析 通过多因素Logistic 回归分析发现标准误及估计的OR 值太大，无法准确显示出属于每个因素的真正的效应量，因此对数据进行转化，将纳入Logistic 回归模型的连续变量×1 000 作为数据转换，重新将基线资料中有意义的数据及转化后的GP1～GP24 纳入模型，危险因素筛选采用逐步向前法。在24 个GP 中发现GP3a、GP6、GP14 和GP15 与房颤术后复发显著相关(表5)。

表5 多因素Logistic 回归分析

2.4 各个聚糖的诊断效能分析 当对在逻辑模型中发现重要的4 个聚糖结构进行ROC 曲线分析时，发现GP3a、GP6、GP14 和GP15 的曲线下面积(area under curve,AUC)分别是0.579、0.648、0.916 和0.640，由此可看出GP14 具有良好的诊断效能(表6,图2)。

表6 ROC 分析结果

图2 ROC 分析曲线

3 讨 论

近年来，随着技术的进步和新治疗策略的发展，对于房颤的治疗主要集中于复律及减少并发症的发生，且对改善患者的远期生存质量也提出了更高要求。因此，为了实现对房颤患者进行有效的规范化治疗，本研究尝试寻找出可以预测房颤术后的生物标志物用以帮助患者选择合适的治疗方案。本研究首次比较了房颤术后复发及未复发人群聚糖结构的差异，探索了房颤复发的危险因素，并且尝试建立了房颤术后复发人群的聚糖谱。

本研究结果表明聚糖结构GP3a、GP6、GP14 和GP15 有复发相关，从结构上来看GP14 和GP15 都是半乳糖基化的聚糖，GP14 每增加0.001 单位时，房颤患者复发的风险为原有的0.787 倍。同时，GP15每增加0.001 单位时，复发风险为原有的0.830 倍。研究[10]表明，在稳定状态下，25%～35%的血清IgG 聚糖均被半乳糖化，且炎症的进展与半乳糖部分数量减少之间存在相关性，即当IgG 聚糖缺失了2 个末端半乳糖时，炎症反应增强。IgG 的半乳糖基化也在抗炎活性中起到一定的作用[11]，当IgG 抗体通过在Fc聚糖末端添加半乳糖，将IgG 抗体从促炎介质转化为抗炎介质时，自身抗体炎症可以得到抑制[12]。当IgG 被半乳糖基化时，聚糖无法与FccRs 结合，C1q无法启动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用和补体的激活[13]。因此根据本研究结果，无半乳糖基化聚糖的指数增长可能有助于增强抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和补体活性的增强，同时也降低了IgG 的免疫抑制的潜能并使促炎活性增强。

另外，GP6、GP14、GP15 都是具有岩藻糖基团的半乳糖基化聚糖，缺乏岩藻糖的Fc 和FccRⅢA，与自然杀伤细胞介导的ADCC 之间的结合以及通过抗体依赖性细胞介导的病毒抑制的抗病毒活性均增加。所以，当仅从聚糖的Fc 部分中去除1 个岩藻糖残基时，在ADCC 启动时IgG 的效力会增加50～100倍。小鼠体内模型的研究[14]表明存在无岩藻糖基化IgG 时，ADCC 的效力会增加。这表明GP6、GP14、GP15 存在岩藻糖部分将有助于降低ADCC 活性，这也与本研究结果相吻合。

本研究通过回归模型筛选出4 个重要的聚糖，对它们进行了ROC 曲线分析，对这4 种聚糖结构作为潜在生物标志物的预测诊断能力和敏感性进行评估，结果发现GP14 在预测复发中敏感性最高，同时，GP14 在房颤复发患者的炎症反应中存在并以91.6%的预测准确性可能成为潜在的诊断生物标志物。

当然，本研究也存在局限性。首先，回顾性研究可能影响数据的质量和完整性，且在GP14 作为一个预测指标应用于临床之前，需要通过大量准确的前瞻性临床试验进行广泛的调查。其次，患者人群来自单一的三级转诊中心。因此，由于这种选择和转诊偏移使得该患者队列可能不代表一般的阵发性房颤人群。另外，本研究仅限于局部地区单中心的绝经后老年女性及老年男性，在未来需扩大研究样本，将中青年患者都纳入分组并且联合多中心进行研究，从而确定聚糖结构的改变是否能适用于不同群体的房颤患者作为术前评价的新指标。目前随访时间较短，在未来需对这类患者进行长期随访，以探索聚糖结构的改变与房颤患者是否会发生心衰住院、卒中、心肌梗死及器官出血等风险的相关性。

综上所述，聚糖结构的改变与房颤术后复发有关，并且GP14 可能作为房颤复发的潜在生物标志物。