CCL5、CXCL10和CXCL13在重度脑外伤患者中的表达和意义*

刘 苏，陆 纯，黄 欢，孙 丽，王司晔

(1 南通大学附属医院康复医学科，南通 226001；2 南通大学医学院)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是影响人类健康的常见疾病之一，其发生率和死亡率均较高[1-2]。重度颅脑损伤患者治疗效果差，致死率和致残率均较高，幸存患者生活质量差[3]。TBI 后继发性损伤中，神经炎症反应一直备受关注，其引发持续炎性免疫反应，损害脑功能[4-5]。神经免疫反应初期分泌大量的促炎和抗炎因子，募集外周免疫细胞和激活脑内星形胶质细胞和小胶质细胞，在此过程中趋化因子是将外周血细胞募集到受损组织的主要介质之一，在神经免疫反应中发挥重要作用。本课题组在前期动物研究[6]中发现导致TBI 大鼠损伤区皮层中趋化因子配体2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)表达增加，抑制其表达可减缓神经功能受损和神经细胞的凋亡。临床研究[7-8]进一步发现趋化因子CCL2、趋化因子CXC 配体[chemokine(C-X-C motif) ligand,CXCL]1 在重度颅脑损伤患者的神经炎症中发挥着重要作用。本研究观察重度TBI 患者外周血中趋化因子CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达变化，分析这些趋化因子对TBI 患者损伤程度和预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 TBI 组血液标本取自2016 年10月—2017 年12 月期间在南通大学附属医院因重度TBI 住院患者39 例，采集时间点分别为术后1 d、3 d和7 d。纳入标准：(1)有明确的颅脑外伤史，如交通事故、高空坠落等，经过CT 等影像学检查明确诊断，并于伤后24 h 内住院；(2)入院时格拉斯哥昏迷评分(Glasgow coma scale,GCS)为3～8 分；(3)达到开颅手术指征，且为入院24 h 内行开颅手术；(4)年龄20～70 岁。排除标准：既往有脑功能损害病史；合并严重心、肺、肝、肾等重要脏器损伤。对照组血液标本取自同期在南通大学附属医院体检中心的健康体检者，共13 名。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经南通大学附属医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

表1 两组一般资料的比较(,n,%)

表1 两组一般资料的比较(,n,%)

1.2 实验方法

1.2.1 外周血清CCL5、CXCL10、CXCL13 检测 TBI组患者于术后1、3 和7 d 抽取静脉血2 mL，对照组于清晨空腹采集外周静脉血2 mL。血液标本采集完毕后室温静置20 min，3 000 r/min 离心15 min 后分离上层血清，随后置于-80 ℃冰箱内保存待测。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自杭州联科生物试剂公司。使用Bio-Tek 全自动酶标仪检测吸光度(optical density,OD)值并计算各样本中CCL5、CXCL10、CXCL13 的浓度。蛋白质浓度通过BCA 蛋白测定法(Pierce，Rockford，IL，美国)进行测定。对于96 孔板中的每个反应，均取100 μg 总蛋白，ELISA 检测方法根据说明书进行操作。

1.2.2 GCS 和格拉斯哥结局量表评分(Glasgow outcome scale,GOS) TBI 患者入院后、术后30 d 运用GCS 评分评估患者的意识障碍程度。GCS 由睁眼反应、语言反应和肢体运动3 个方面组成，最高15 分，为意识清楚；12～14 分为轻度意识障碍；9～11 分为中度意识障碍；≤8 分为昏迷；分数越低则表示意识障碍越严重。术后30 d 采用GOS 评分评估判断患者预后情况。GOS 评分：1 分，死亡；2 分，持续性植物状态；3 分，重度残疾；4 分，中度残疾；5 分，恢复良好。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行数据分析，数据均以表示，P<0.05 为差异有统计学意义。重度TBI 组的不同时间点外周血清中CCL5、CXCL10、CXCL13 表达含量分别和对照组相比采用Dunnett检验；重度TBI 患者不同时间点外周血清中CCL5、CXCL10、CXCL13 表达含量与入院当天GCS 评分、术后30 d GCS 评分和GOS 评分间的相关性分析采用Spearman 法。

2 结 果

2.1 两组外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达 TBI 组患者3 种趋化因子在术后1 d 表达均最高，随后表达逐渐下降，但表达量仍保持较高水平。与对照组相比，TBI 组患者外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达量均明显升高。表明CCL5、CXCL10、CXCL13 这3 种趋化因子在重度TBI 患者中表达增高，且在疾病早期表达即达高峰，随后逐渐下降(表2)。

表2 两组外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达(,pg/mL)

表2 两组外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达(,pg/mL)

2.2 重度TBI 患者外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达量与GCS、GOS 评分的相关性分析 结果表明，重度TBI 患者术后1 d 血液中CCL5 的蛋白浓度与入院GCS 评分、术后30 d GOS 评分呈负相关(P<0.05,P<0.01)。术后1 d 血液中CXCL10 浓度与GOS 评分呈负相关(P<0.05)，术后3 d CXCL10 的浓度与术后30 d GCS 评分呈负相关(P<0.05)，与GOS评分呈负相关(P<0.05)。术后1 d 血液中CXCL13 表达量与入院GCS 评分呈负相关(P<0.05)，术后7 d 与GOS 评分呈负相关(P<0.05)(表3)。

表3 TBI 患者血液CCL5、CXCL10、CXCL13 与GCS、GOS 评分的相关分析

3 讨 论

趋化因子是细胞因子家族中的一个大亚群，可将多种免疫细胞吸引到损伤部位。研究[9-12]表明与TBI 有关的趋化因子有很多，包括CCL2、CCL20、CXCL1、CXCL8、CXCL10、CXCL11、CXCL12 等。在中枢神经系统中，CCL5 及其受体具有多种功能，包括促进神经炎症反应、调节突触活动和针对各种神经毒素的神经保护作用等。CCL5 主要定位于脑内少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。A.DÉNES等[13]发现，慢性感染可通过CCL5 介导全身炎症反应并加剧脑损伤的发生，说明CCL5 可介导炎症反应并延迟炎症消退，加重颅内损伤。中枢神经系统损伤后，在星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和神经元中可以发现CCL5 及其受体CCR5 表达上调。本研究发现重度TBI 患者外周血液内CCL5 在损伤早期表达迅速升高，术后1 d 最高，随后逐渐下降，但术后7 d 仍明显高于对照组，说明CCL5 在脑损伤后持续存在，参与神经炎症反应。CXCL10 可被单核细胞、巨噬细胞、T 细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞所吸引，具有促进T 细胞黏附于内皮细胞、抗肿瘤活性以及抑制骨髓集落形成和血管生成等作用。脑损伤后CXCL10 在神经元中表达，通过激活的小胶质细胞将其募集至损伤部位。在小鼠TBI 模型中发现皮质和皮质下区域中CXCL10 的细胞簇迅速出现[14]。CXCL10 以剂量依赖性方式诱导人脑微血管内皮细胞和神经胶质细胞凋亡，表明CXCL10 水平升高在血管病变和脑损伤过程中产生作用，通过降低CXCL10 的水平可促进血管生成、减少凋亡细胞数量和增加血管内皮生成因子的生成[15]。本研究通过测定重度TBI 患者外周血液中趋化因子CXCL10 的蛋白量发现，与对照组相比，CXCL10 表达明显增高，早期表达高且下降缓慢，至术后7 d 表达量仍处于较高水平。通过细胞学水平研究[16]发现，给予原代培养的小胶质细胞炎性刺激后，小胶质细胞迅速分泌CXCL13，且表达量较高。本研究中重度TBI 患者外周血清中趋化因子CXCL13 主要在TBI 早期表达较高，随后下降，可能更多地参与脑损伤的早期病理过程。

CXCL12 及其受体CXCR4 参与包括TBI 等多种神经系统疾病的发展。与对照组或TBI 后30 d 仍存活的患者相比，死亡患者的血液中CXCL12 浓度显著增加，且血液CXCL12 浓度与损伤后的严重程度及30 d 死亡率密切相关，可作为30 d 死亡率的独立预后预测因子，表明CXCL12 可能成为TBI 的新型预后生物标志物[17]。新近研究[18]进一步证实血液CXCL12 可作为颅脑损伤患者预后的有效生物标志物。大鼠血液CCL2(即MCP-1)表达量与颅脑损伤程度呈正相关，可作为评判大鼠TBI 程度的观察指标[19]。我们前期临床研究[7-8]也发现在重度TBI 患者的受损脑组织的神经元和星形胶质细胞上发现有CXCL1 和CCL2 的表达，且特重型TBI 患者脑损伤程度与外周血中CXCL1 和CCL2 浓度呈负相关，即CXCL1、CCL2 表达量越高，脑损伤越重，预后越差。通过Spearman 相关性分析发现，重度TBI 患者术后1 d 血液中CCL5 的蛋白浓度与入院GCS 评分呈负相关，术后3 d CXCL10 的浓度与术后30 d GCS 评分呈负相关，术后1 d CXCL13 表达量与入院GCS评分呈负相关，提示外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表达量与损伤程度具有相关性，即表达量越高，脑损伤程度越严重。同时，重度TBI 患者术后1 d CCL5 的浓度与术后30 d GOS 评分呈负相关，术后1 d 和3 d 的血液中CXCL10 浓度与GOS评分呈负相关，术后7 d CXCL13 浓度与GOS 评分呈负相关提示CCL5、CXCL10 和CXCL13 与患者的预后相关，即表达量越高，预后可能越差。

综上所述，CCL5、CXCL10、CXCL13 在TBI 早期的神经炎症反应中发挥重要作用，在脑损伤后其表达量迅速增加，在一定程度上与脑损伤的严重程度相关，且其表达量与患者的预后有一定的相关性。