聚乙二醇化锌铁氧磁性纳米颗粒对咪喹莫特的载药性能及细胞毒性研究

刘庆祖，刘建恒，王润生,2，刘义灏，杨慧恺，毛克亚

1 解放军总医院第一医学中心，北京 100853；2 柳州市中医院，广西柳州 545001

磁性纳米颗粒由于比表面积大、磁响应性高、生物相容性好而广泛应用于热疗、生物分离、靶向给药、核磁共振成像的研究[1-4]。但在液态环境中纳米颗粒容易聚合，导致其生物相容性降低[5]。因此，研究人员对磁性纳米颗粒表面进行修饰，将纳米颗粒系统设计成不同的壳核结构[6]。理想的修饰材料为两亲性，疏水端对颗粒亲和力较高，亲水端可提高磁性纳米颗粒在液态介质中的分散性和水溶性[7]；且修饰材料所携带的氨基、羟基可作为与抗体、氨基酸、叶酸、小分子药物等的结合位点[8-12]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是呈线性或分支状聚醚的亲水性聚合物，其水溶性高、生物相容性高、几乎无免疫原性，可在搭载药物的周围产生空间屏障，降低搭载药物的酶解，提高药物利用度[13-14]。咪喹莫特(R837)是一种强效的Toll样受体7兴奋剂，可以有效激活免疫反应[15]，可搭载至磁性纳米颗粒表面以增强磁热疗后的免疫反应。叶酸是一种无免疫原性且价格低廉的小分子，其受体在肿瘤表面大量表达，在正常细胞表面低表达[16]。利用这一特性将叶酸耦连至磁性纳米颗粒-聚乙二醇(polyethylene glycol-magnetic nanoparticles，PEGMNPs)表面，可使PEG-MNPs磁流体具有较好的肿瘤靶向性。本研究以乙酰丙酮锌、乙酰丙酮铁、油酸和油酸钠为原料合成Zn0.3Fe2.7O4MNPs，并对其进行PEG、R837的表面修饰构建MNPs-PEG-R837系统，进一步对系统表面搭载叶酸，制备MNPs-PEG-R837-FA系统，对其性能进行检测及表征，使用CCK-8法检测该复合物细胞毒性。为后期对人骨肉瘤细胞MG-63进行内吞实验、细胞内磁热疗实验、激活免疫系统奠定研究基础。

材料与方法

1 试剂与仪器 乙酰丙酮锌、乙酰丙酮铁、油酸钠(中国Alfa aesar公司)；EDC偶联剂，油酸，二苄醚(德国Sigma Aldrich公司)；DSPE-mPEG，DSPE-PEG-NH2(瑞禧生物)；咪喹莫特(麦克林生物)；PEG化叶酸(碳水科技)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青霉素、链霉素、DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Gibico公司)；小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)、人骨肉瘤细胞MG-63(上海通派生物公司)；细胞活性检测试剂盒(CCK-8，日本株式会社同仁化学研究所)；通风橱(北京蝴蝶实验室家具有限公司)；电子分析天平(BSA124S，德国SartoriusAG公司)；超声震荡仪(SW1H，瑞士SONOSWISS公司)；光纤测温系统(34722，加拿大Nepotix公司)；振动样品磁强计(3473-70，新西兰GMW公司)；透射电子显微镜(JEM-2100，日本电子株式会社JEOL)；高速冷冻离心机(3K15，德国Sigma Aldrich公司)；动态激光光散射仪(Zeta Plus，美国Brookhaven Instruments公司)；高效液相色谱仪(LC-15C，日本岛津公司)；X线衍射分析仪(X'Pert PRO MPD，日本理学公司)；热失重分析仪(美国PerKinElmer公司)；傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet IS 10，美国Thermo公司)。全自动酶标仪(Infinited M2000 PRO，瑞士TECAN公司)。

2 Zn0.3Fe2.7O4MNPs的合成 采用高温有机溶剂法合成。首先将乙酰丙酮锌(0.3 mmol)、乙酰丙酮铁(2.7 mmol)、油酸钠(2 mmol)、油酸(4 mL)以及二苄醚(20 mL)在通氩气的环境中混合，采用磁力搅拌器充分混合，并在通氩气的环境中加热至393 K，保温1 h。然后加热至573 K，保温1 h后退热至室温。

3 MNPs-PEG-R837的制备 采用逆向蒸发法合成MNPs-PEG-R837。将150 mg DSPE-mPEG、50 mg DSPE-PEG-NH2和1 mg咪喹莫特加至4 mL氯仿中超声溶解；向上述溶液中加入20 mg Zn0.3Fe2.7O4超声混匀，再加入4 mL水，超声使水和氯仿混匀；采用旋转蒸发法将氯仿除去得到PEG/R837包裹的MNPs-PEG-R837。

4 MNPS-PEG-R837-FA的制备 将5 mg FA-PEGCOOH、溶于5 mL NaHCO3溶液中(15 mmol/L，pH=9)，pH调节至7；加入10 mg MNPS-PEG-R837，用PB溶液(0.02 mmol/L，pH=7.4)定容至6.5 mL，混匀震荡在26℃下孵育30 min；再加入10 mg EDC，混匀震荡，26℃下孵育过夜，取出溶液进行超滤纯化得到最终的产物。

5 评估Zn0.3Fe2.7O4MNPs-PEG-R83载药率、包封率 载药率是载药纳米系统复合体搭载药物的质量占复合物系统总质量的百分比，反映该载药纳米系统复合体搭载药物的能力，载药率的计算公式：

载药率=复合体搭载药物的质量/载药纳米系统复合体总质量×100%，

包封率=(投入药物总量-下清液剩余药物量)/投入药物总量

6 Zn0.3Fe2.7O4MNPs-PEG-R837药物释放率检测 分别取1 mL样品溶液加入透析袋(截留分子量8 000～14 000 U)，放入盛有5 mL PBS缓冲液(pH=5.8)的15 mL离心管中；将离心管置于37℃或43℃的恒温摇床上，200 r/min震荡；分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h和24 h时从离心管中取1 mL释放液装到样品管中待测浓度，随机取同等温度下的PBS缓冲液加入离心管中继续震荡；通过HPLC测试每个时间点取出的释放液的咪喹莫特含量。

7 细胞培养 1)细胞复苏：取MEF细胞冻存管，水浴解冻后用75%乙醇消毒顶部备用，配用10 mL高糖培养基 + 15%胎牛血清，将细胞冻存管内的细胞重悬于离心管内，并加入青霉素/链霉素双抗预防细胞污染。取2 mL重悬细胞，移入25 cm2细胞培养瓶，加适量培养基，在操作台缓慢轻柔以“∞”形晃动培养瓶，直至在显微镜下观察细胞悬浮良好，分散均匀，消毒后放置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，12 h后观察细胞生长贴壁情况。2)每日观察细胞生长情况，待培养基由浅淡红色变成淡棕黄色时准备换液。3)取指数增长期MEF细胞制作细胞悬液，调整细胞浓度为1 × 104/mL，实验组、阴性对照组、Blank组均设置5个复孔，各孔加样量100 µL，96孔板四周孔加无菌磷酸盐缓冲液，放置于37℃、5% CO2、100%湿度的恒温细胞培养箱24～48 h。

8 检测Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837对MEF、MG63两种细胞系的生物毒性 将Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837纳米颗粒载药配置成磁流体，按照实验组浓度梯度分为50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL、400 µg/mL、600 µg/mL、800 µg/mL、1000 µg/mL，共7组，直接加入含细胞的96孔板中，阴性对照组加等量完全培养基，空白对照组无细胞只加入等量含10% CCK-8的完全培养基，每组均设置5个复孔，利用全自动酶标仪在450 nm处测定各复孔的细胞活性，并计算细胞相对增殖率。检测时间点为孵育24 h、48 h。

9 统计学分析 采用SPSS26.0软件对数据进行统计学处理，细胞相对增殖率以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒X射线衍射(XDR)结果 Zn0.3Fe2.7O4纳米颗粒XDR图中出现6个主要的衍射峰，并且各衍射峰的位置和相对强度均与锌铁氧体的XRD标准图谱(JCPDS-74-2397)一致，对应的衍射晶面分别为(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，所得产物是立方体尖晶石结构的Zn0.3Fe2.7O4纳米颗粒。图中没有其他杂峰，表明所得产物具有高纯度，且衍射峰出现明显的变化。见图1。

图1 Zn0.3Fe2.7O4纳米颗粒XDR图Fig.1 XDR of Zn0.3Fe2.7O4 nanoparticles

2 Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒、MNPs-PEG-R837、MNPs-PEG-R837-FA傅里叶红外光谱(FT-IR) 图2中a、b、c分别为MNPs、MNPs-PEG-R837、MNPs-PEG-R837-FA的红外光谱谱图。a中2 918 cm-1和2 852 cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动，1 597 cm-1和1 407 cm-1处的吸收峰为羧酸盐-COOM(M为金属离子)耦合反对称和对称伸缩振动，1 112 cm-1处的吸收峰为C-O-C伸缩振动，580 cm-1处的吸收峰是典型的M-O(M为金属离子)的伸缩振动。在b中除了a所有的特征峰外，3 337 cm-1处的吸收峰为-NH2伸缩振动，而且C-H和C-O-C伸缩振动峰的强度增强表明DSPE-PEG-NH2的成功修饰。此外1 652 cm-1处的吸收峰为N-H弯曲振动，苯环上的C-N伸缩振动发生在1 281 cm-1处，C-N的弯曲振动在964 cm-1和842 cm-1处，表明咪喹莫特成功负载。c中除了a和b中的所有特征峰外，在1 741 cm-1处出现了-COOH中C=O的伸缩振动峰，说明叶酸的成功修饰。

图2 Zn0.3Fe2.7O4 MNPs、MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA的FT-IR傅里叶红外光谱Fig.2 FT-RI results of Zn0.3Fe2.7O4 MNPs, MNPs-PEG-R837,MNPs-PEG-R837-FA

3 透射电镜(TEM)形态表征 图3A为Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒包覆PEG前的检测结果，提示磁性纳米颗粒呈多面体结构，所制备的颗粒粒径为(25.1 ± 3.4) nm，呈单分散性，颗粒的粒径均匀。图3B为Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837检测结果可以明显看出制备复合纳米颗粒系统为典型的壳核结构，说明PEG以及R837成功包覆在Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒，将油性Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒转变成水溶性颗粒。

图3 Zn0.3Fe2.7O4(A)和Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837(B)的透射电镜图Fig.3 TEM images of Zn0.3Fe2.7O4 (A) and Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837 (B)

4 磁流体胶体的稳定性检测 将Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837溶于超纯水(1 mg/mL)静置0 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后磁流体分散均匀，未出现沉淀、团聚现象(图4)。表明PEG化后的Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒具有良好的胶体稳定性，适合生物应用。

图4 磁流体胶体的稳定性检测Fig.4 Stability of magnetic fluid colloid

5 MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA流 体动力学粒径(DLS)和Zate电位 图5为MNPs-PEG-R837偶联FA前后的DLS和Zate检测结果。MNPS-PEG-R837的流体动力学粒径为(117 ±6) nm，Zate电位为(-24.5 ± 1.7) mV。表面偶联FA后，水动力尺寸呈现逐渐递增的趋势，Zeta也呈现下降的趋势。MNPS-PEG-R837-FA流体动力学粒径为(122 ± 5) nm，Zeta电位为(-27.9 ± 1.7) mV。上述结果表明PEG及R837成功包覆在Zn0.3Fe2.7O4磁性纳米颗粒表面以及 FA的耦连。

图5 MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA的DLS和Zate电位Fig.5 DLS and Zate of MNPs-PEG-R837 and MNPS-PEG-R837-FA

6 MNPs-PEG-R837-FA的 热 失 重 分 析(TGA)图6为室温加热到800℃条件下测得最终产物的热失重曲线，包括TGA(黑线)和DTG(蓝线)。TGA呈现的是样品的失重过程，DTG显示的是最大失重速率所对应的温度。可以看出样品只发生一步失重过程，开始失重温度为330.1℃，终止失重温度为478.5℃，最大失重速率温度为378.2℃。由样品的制备过程可以推断，当温度上升到330℃时，样品中负载的PEG、R837以及表面偶联的叶酸等有机物发生了降解，导致质量的损失，此时的质量变化为78.66%。随着温度的进一步升高，样品的质量不再发生变化，最终的残留质量为21.05%，为Zn0.3Fe2.7O4MNPs的质量。

图6 MNPs-PEG-R837-FA热失重分析Fig.6 TGA of MNPs-PEG-R837-FA

7 R837的载药率、包封率 采用高效液相色谱法(HPLC；WondaSil C18)测定咪喹莫特浓度标曲线，流动相A为70%乙腈，流动相B为30%的0.02 mol/L磷酸氢二钾缓冲液(磷酸调pH=8)(1.0 mL/min, 35℃，12 min)，得到R837峰面积/浓度标准曲线(图7)。MNPs-PEG-R837表面耦连FA完成后取10 mL下清液，通过计算得出咪喹莫特载药率为87.90%、包封率为4.4%，见表1。

表1 R837的包封率和载药率Tab. 1 Drug loading and encapsulation rate of R837

图7 咪喹莫特的峰面积/浓度标准曲线Fig.7 Standard concentration curve of imiquimod

8 R837的释放率 根据不同时间R837在透析袋中的释放浓度计算其释放率，以时间为横坐标，累计释放百分数为纵坐标绘制累计释放曲线。由R837的体外释放曲线可知，在前6 h内，两种释放温度条件下，R837的释放较慢；6 h时，在37℃条件下的释放量达到了27.31%，而43℃条件下的释放量达到了45.86%，说明该药物载体系统在热疗所需的温度下累积释放率和释放速率均有明显升高；随着时间的延长，R837的累计释放量呈现逐渐增大的趋势，12 h后R837在两种温度条件下的释放已经接近平衡，最大释放量达到88%左右。药物载体在药物释放方面符合要求，有望成为新型的药物缓释载体，为后期对MG-63细胞的磁热疗及热疗后免疫刺激奠定了试验基础。见图8。

图8 Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837在37℃和43℃条件下的体外释放曲线Fig.8 Release curve of Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837 with the temperature of 37℃ and 43℃

9 振动样品磁强计测定 图9为Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837在室温下的磁滞回线：该样品磁感应强度在5000 Oe逐渐达到饱和，饱和磁化强度为43.1 emu/g，撤去外加磁场之后，剩余磁化强度和矫顽力基本为0，表明该纳米材料具有超顺磁性。

图9 Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837在室温下的磁滞回线Fig.9 Hysteresis loop of Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837

10 MNPs-PEG-R837对MEF、MG63细胞的生物毒性 MNPs-PEG-R837磁流体对于两种细胞系的细胞毒性随浓度上升而增加，但两组细胞在24 h内，即使MNPs-PEG-R837浓度达到1 000 µg/mL也未表现出明显的细胞毒性。MNPs-PEG-R837浓度增至800 µg/mL，与MEF细胞共孵育时间延长至48 h时，才出现细胞毒性；MNPs-PEG-R837浓度增至1 000 µg/mL，与MG-63细胞共孵育48 h时的细胞毒性，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。两组细胞在MNPs-PEG-R837浓度600 µg/mL以下孵育48 h仍未出现细胞毒性。表明该磁性纳米颗粒复合载药系统有较低的细胞毒性(图10)。

图10 MNPs-PEG-R837对MEF (图A)、MG63(图B)细胞的生物毒性(aP＜0.01 vs control)Fig.10 MG63 (panel A) and MEF (panel B) cytotoxicity of MNPs-PEG-R837 (aP＜0.01 vs control)

讨 论

本文利用高温有机溶剂法合成了平均粒径为(25.1 ± 3.4) nm的Zn0.3Fe2.7O4锌铁氧体磁性纳米颗粒，该颗粒在饱和磁化强度为5000 Oe下逐级达到饱和，撤去外加磁场之后，剩余磁化强度和矫顽力基本为0，表明该纳米材料具有超顺磁性。利用逆向蒸发法将聚乙二醇和免疫佐剂咪喹莫特修饰至颗粒表面构建了MNPs-PEG-R837磁性纳米颗粒复合载药系统，进一步将叶酸修饰至该系统，改善锌铁氧磁性纳米颗粒的生物相容性。肿瘤部位微环境pH为5.5左右[17]，咪喹莫特是一种弱碱性药物，在pH＜6.5的溶液中溶解度明显增加，在外加磁场的作用力下，可定向移动至肿瘤部位，在37℃条件下释放量达到了27.31%，而43℃条件下释放量达到了45.86%，这说明在该药物载体系统在热疗所需的温度下，累积释放率和释放速率均有明显增加，随着时间的延长，咪喹莫特的累计释放量呈现逐渐增高的趋势，进一步提高药物利用率。随着时间的延长，R837的累计释放量呈现逐渐增高的趋势，12 h后R837在两种温度条件下的释放已经接近平衡，最大释放量达到88%左右。药物载体在药物释放方面符合要求，有望成为新型药物缓释载体。与Taratula等[18]的研究结果相比，本研究在药物释放方面更具优势。MNPs-PEG-R837-FA磁流体和MEF细胞共同孵育24 h后，MNPs-PEG-R837-FA磁流体的浓度升高，而细胞毒性未明显增加，即使浓度达到1 000 µg/mL，仍表现为无细胞毒性；MNPs-PEGR837-FA磁流体和MG-63细胞共同孵育24 h后，MNPs-PEG-R837-FA磁流体的浓度升高，而细胞毒性未明显增加，MNPs-PEG-R837-FA磁流体的浓度增至1 000 µg/mL时，出现了轻度细胞毒性，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。与Makridis等[19]的研究结果相比，本研究所使用磁性纳米颗粒浓度更高、孵育时间更长，表明该磁性纳米复合载药系统具有较好的生物相容性。本研究显示了磁性纳米颗粒作为药物载体的应用前景，为磁性纳米颗粒应用于临床提供了理论研究基础。但本研究未进行肿瘤动物模型的体内相容性研究，这也是课题组下一步的研究方向。