血红素氧合酶1对高糖诱导人晶状体上皮细胞的氧化应激和凋亡的影响

张 奇，马天驹，黄 杨，李朝辉

解放军总医院第一医学中心 眼科，北京 100853

白内障形成的因素有很多，其中糖尿病是最重要的危险因素。随着人口老龄化的加剧和人们生活水平的提高，糖尿病的发病率一直在上升，已严重影响到人们的生活质量[1]。糖尿病性白内障是导致患者视力下降的主要原因之一。持续的高血糖通过改变晶状体的渗透压、诱发晶状体氧化应激等途径，加速白内障的发生发展[2-3]。虽然目前手术是治疗白内障的有效方式，但糖尿病患者术中危险程度高，术后并发症较多，因此迫切需要一种药物用于干预治疗[4]。血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是Hmox-1基因编码的热休克蛋白，存在于身体的各个组织和器官中，其将血红素以限速的方式分解为三种重要的副产物 —— 一氧化碳、亚铁和胆绿素[5]。在各种病理生理条件的刺激下，人体内可产生HO-1[6]。研究发现降低氧化因子或增加抗氧化因子的产生，可能是治疗和预防白内障的有效方式，而HO-1及其产物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[6]。因此我们假设HO-1对白内障有治疗作用，用高糖诱导晶状体上皮细胞为模型模拟葡萄糖性白内障，运用HO-1诱导剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)和抑制剂锌原卟啉(zinc protoporphyrin，ZnPP)上调或下调HO-1的表达，观察HO-1是否对高糖诱导的晶状体上皮细胞有保护作用，为糖尿病白内障寻找有效的药物干预方式。

材料与方法

1 材料 人晶状体上皮细胞系(SRA01/04，中国广州吉妮欧生物科技有限公司)；D-葡萄糖(Solarbio，中国)；HO-1抗体(Cambridge，英国)；钴原卟啉，锌原卟啉(St Louis，MO，美国)；青霉素链霉素溶液(Hyclone，美国)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双试剂盒(碧云天，中国)；CCK-8检测试剂盒，活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒(碧云天，中国)。

2 晶状体上皮细胞(SRA01/04)的培养与分组 晶状体上皮细胞(SRA01/04)培养于10%胎牛血清的1640培养液中，置于25 cm2培养瓶，于37℃、5% CO2孵育箱中培养。待细胞完全融合至80% ～ 90%时经0.25%含EDTA胰酶消化，按1∶3传代，取良好的对数生长期的细胞进行实验。将实验分为高糖处理组和正常处理组，高糖处理组在1640培养液中添加葡萄糖，浓度分为15 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L；5 mmol/L为正常对照组。

3 CCK-8实验检测不同浓度下晶状体上皮细胞(SRA01/04)的增殖活力 将对数生长期的SRA01/04细胞用0.25% EDTA胰酶消化后，于基础溶液中重悬，按4×104/L的细胞密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 mL，设置6个孔重复。常规培养24 h，待细胞贴壁后，按上文中高糖处理组和正常对照组的要求更换培养液，继续培养24 h，培养结束后弃上清液，于避光条件下每孔加入100 mL CCK-8试剂，37℃、5% CO2恒温反应24 h后，置于微板孔分光光度计450 nm波长处取吸光度(OD)值。

4 流式细胞术测定细胞内ROS相对含量 用二氯荧光素二乙酸DCFH-DA检测试剂盒。对数期人晶状体上皮细胞6组接种于24孔板中，称取180.2 mg的葡萄糖，加1 mL基础培养基配制成1 mol/L母液进行过滤，配置所需葡萄糖浓度，DMSO稀释为10 mmol/L母液过滤，分别培养3组，共分为6组：正常组(control) 5 mmol/L，高糖组(D) 100 mmol/L，将CoPP、ZnPP用母液稀释1 000倍至10 µmol/L，加入高糖组和正常组培养基中，形成Control 5 mmol/L + CoPP 10 µmol/L组、Control 5 mmol/L + ZnPP 10 µmol/L组、D 100 mmol/L + CoPP 10 µmol/L组、D 100 mmol/L +ZnPP 10 µmol/L组，6组均培养24 h后，按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 µmol/L。去除细胞培养液，加入稀释好的DCFH-DA。活性氧阳性对照孔加1∶1 000稀释的试剂刺激细胞20 min，37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。立即采用流式细胞仪(BD)在激发波长(Ex)为488 nm和发射波长(Em)为530 nm处检测。

5 Annexin V-FITC/PI检 测 细 胞 凋 亡 比 例 用Annexin V-FITC/PI测量细胞凋亡的比例。对数期人晶状体上皮细胞接种于24孔板中，调整细胞密度至1×106/mL，将0.2 mL细胞悬液从细胞培养板中(2×105个细胞)用移液枪转移到干净的离心管中；室温1 000 g离心5 min，去除培养基。分组培养24 h后(Control 5 mmol/L组；Control 5 mmol/L + CoPP 10 µmol/L组；Control 5 mmol/L +ZnPP 10 µmol/L组；D 100 mmol/L组；D 100 mmol/L +CoPP 10 µmol/L组；D 100 mmol/L + ZnPP 10 µmol/L组)，用0.2 mL预冷的PBS溶液轻轻重悬，室温1 000 g离心5 min，去上清；细胞沉淀用0.2 mL预冷的结合缓冲液轻轻重悬，加入5 µL Annexin-FITC、5 µL PI染液，轻轻混匀，室温(18℃～24℃)下避光孵育10～15 min，用流式细胞仪检测(Ex=488 nm；Em=530 nm)细胞凋亡率。

6 镜下观察培养各组细胞凋亡形态学变化 在显微镜下观察6组(Control 5 mmol/L组；Control 5 mmol/L + CoPP 10 µmol/L组；Control 5 mmol/L +ZnPP 10 µmol/L组；D 100 mmol/L组；D 100 mmol/L +CoPP 10 µmol/L组；D 100 mmol/L + ZnPP 10 µmol/L组)已干预细胞的凋亡形态学改变。

7 统计学分析 采用SPSS20.0进行统计分析，计量数值以表示。采用单因素方差分析进行多组均数比较，两两比较采用Dunnett's 检验或Tukey’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞增殖活力 CCK-8检测结果显示，15 mmol/L葡萄糖在24 h内对晶状体上皮细胞无影响(P＞0.05)。当葡萄糖浓度达到30 mmol/L时，晶状体上皮细胞增殖活力升高(P＜0.01)。当葡萄糖浓度持续升高至50 mmol/L时，晶状体上皮细胞的增殖活力也随之升高(P＜0.01)。当葡萄糖浓度达到100 mmol/L时，细胞增殖活力降低(P＜0.01)。见图1。

图1 晶状体上皮细胞(SRA01/04)在不同浓度葡萄糖中培养24 h的增殖活性(CCK-8检测)(aP＜0.01，vs control)Fig.1 Proliferative activity of lens epithelial cells (SRA01/04)cultured in different glucose concentrations for 24 h (CCK-8 test)(aP＜0.01, vs control)

2 HO-1抑制高糖诱导晶状体上皮细胞产生ROS 使用荧光探针DCFH-DA流式细胞仪测量ROS的产生。高糖组(D组)细胞内ROS相对含量增加至51.63%±1.74%，是正常组(Control组)ROS相对含量(4.70%±1.27%)的10倍余。高糖组加入HO-1诱导剂CoPP后(D + CoPP组，43.37%±2.08%)，细胞内ROS相对含量较高糖组(D组)明显降低(P＜0.01)；高糖组加入HO-1抑制剂ZnPP后(D + ZnPP组，60.10% ±1.54%)，细胞内ROS相对含量较高糖组(D组)明显升高(P＜0.01)。见图2。

图2 流式细胞术测定各组ROS相对含量(aP＜0.01，vs control；bP＜0.01，vs group D)Fig.2 ROS levels in each group were measured by Rhyndrocytometry (aP＜0.01, vs control; bP＜0.01, vs group D)

3 HO-1可减轻高糖诱导下SRA01/04的细胞凋亡 流式细胞术显示，高糖组(D组)细胞凋亡比例为39.56%±0.50%，明显高于正常组的3.05%±0.35%(P＜0.01)。高糖组加入HO-1诱导剂CoPP后(D + CoPP组，33.72%±2.05%)，细胞凋亡率较高糖组(D组)明显降低(P＜0.001)；高糖组加入HO-1抑制剂ZnPP后(D + ZnPP组，44.53%±0.48%)，细胞凋亡率较高糖组(D组)明显升高(P＜0.01)。见图3。

图3 流式测定各组细胞凋亡率的比较(aP＜0.01，vs control；bP＜0.01，vs group D)Fig.3 Comparison of the proportion of apoptosis in each group by flow cytometry (aP＜0.01, vs control; bP＜0.01, vs group D)

4 镜下观察细胞形态学变化 镜下观察到高糖组(D组)细胞的形态发生明显改变，游离死细胞明显多于正常组，当各自加入诱导剂CoPP后，形态规则、生长良好的细胞明显增多；反之，当各自加入抑制剂ZnPP后，形态规则、生长良好的细胞明显减少。见图4。

图4 各组培养晶状体上皮细胞形态Fig.4 Morphology of cultured lens epithelial cells in each group

讨 论

糖尿病患者的晶状体抗氧化酶(如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)异常，从而导致氧化应激[7-8]。氧化应激对晶状体上皮细胞造成直接的损伤，如蛋白的交联、聚集和沉淀，此过程中产生有毒物质，最终导致白内障[9-10]。缺乏HO-1的小鼠很难维持晶状体的透明度，随着时间的延长，其晶状体越来越浑浊[9,11]。多项研究均证实HO-1具有保护细胞免受氧化应激、抗增殖、抗辐射等作用[11-14]。

ROS是氧正常代谢的天然副产物，在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用，ROS可触发细胞死亡的生理或程序途径[15-18]。高糖诱导引起的氧化应激产生ROS，扰乱了抗氧化系统，使自由基大量积累，内环境平衡遭到了破坏，被认为是白内障发生和发展的分子基础[19]。因此抗氧化剂可延缓白内障的进展。本实验中，加入HO-1诱导剂CoPP组的ROS相对含量明显减少，加入HO-1抑制剂ZnPP组的ROS相对含量明显升高。

本实验中，在急性高糖的刺激下，晶状体上皮细胞形态学发生改变，出现明显的生长脱离、胞质收缩、细胞核大小不一、死细胞漂浮等变化。高糖组(D组)细胞凋亡比例(39.56%± 0.50%)较对照组(3.05%±0.35%)明显升高。根据细胞水平检测，HO-1高表达时，加入HO-1诱导剂CoPP组(Control + CoPP组、D + CoPP组)细胞凋亡比例较低；HO-1低表达时，加入HO-1抑制剂ZnPP组(Control + ZnPP组、D + ZnPP组)细胞凋亡比例明显高于对照组。HO-1的高表达明显抑制了ROS的相对含量，从而使细胞的凋亡比例明显下降，抵御了氧化应激带给细胞带来的损伤，这与其对肝损伤、血管疾病、缺血再灌注损伤的保护作用相符[20]。这些结果均表明，HO-1对高糖诱导晶状体上皮细胞产生的氧化应激和凋亡有保护作用。

综上所述，本研究通过HO-1激动剂CoPP和抑制剂ZnPP调节HO-1的表达水平，发现HO-1对高糖诱导晶状体上皮细胞的损害起到了一定的保护作用。HO-1是一种潜在治疗糖尿病性白内障的措施。然而由于实验的局限性，并没有数据证明HO-1在体内是否对糖尿病性白内障起到有效的保护作用，进一步将细胞培养结果转化为动物研究是非常必要的。本研究的结果提示HO-1体内治疗糖尿病性白内障或成为可能。