胸腔积液GeneXpert MTB/RIF对结核性胸膜炎的诊断价值研究

文玉琪 崔丹 刘朋冲 赵杰 李志惠

胸腔积液常见的原因之一为结核性胸膜炎，早期诊断对于有效治疗和控制该疾病至关重要。结核性胸膜炎的诊断基于患者临床表现、影像学特征和实验室检查几个方面，其中实验室检查包括细胞学、生物化学和细菌学检查和胸膜活检[1]。从患者的胸腔积液的抗酸染色涂片检查及培养检查找到结核菌的阳性率比较低，分别约为10%和20%，并且结核菌培养的方法需要的时间也较长(4～8周)[2]。胸膜活检是一种侵入性的手术，花费高，创伤性大，不适用于所有患者，此外，胸膜组织活检进行组织学检查可能仍有20%左右的假阴性率[3]。目前结核性胸膜炎在诊断方面仍然具有挑战性。一些生化指标，如腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)已被证明是一种有价值的生化标记物，在辅助诊断结核性胸膜炎方面的敏感性和特异性相对较好，在结核性胸膜炎的辅助诊断中应用较为广泛。如若结核性胸膜炎诊断不及时，可能会延迟有效的医学干预，而延迟抗结核治疗可能导致胸膜增厚或结核性脓胸，而最后需要手术治疗。所以，目前急需研发高敏感、高特异并且快速的工具来辅助诊断结核性胸膜炎。核酸扩增测试技术的进步大大缩短了结核病诊断的时间，其中GeneXpert MTB/RIF是世界卫生组织推荐的、快速并且自动化的核酸扩增方法，在检测痰标本中的结核分枝杆菌复合物和利福平耐药性上应用较为广泛[4]，自问世以来，它辅助诊断结核病的价值备受关注，但是笔者发现用其检测来辅助诊断结核性胸膜炎的研究相对较少。本研究评估了胸腔积液中的GeneXpert MTB/RIF在诊断结核性胸膜炎方面的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年11月至2020年11月在河北省胸科医院进行治疗的胸膜炎患者共128例，其中结核性胸膜炎78例(结核组)，男62例(79.5%)，女16例(20.5%)；年龄中位数为52(35，67)岁；非结核性胸膜炎50例(非结核组)，其中男32例(64.0%)，女18例(36.0%)；年龄中位数为61(43.75，72)岁。2组患者的年龄和性别比差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 2组患者的一般资料分析

1.2 判断标准 结核组使用综合参考标准(composite reference standard，CRS)进行判断，包括临床表现、常规生化检测、胸腔积液抗酸染色、组织病理学及抗结核治疗的反应[5]。非结核组患者中表现为恶性胸腔积液的患者都有病理细胞学的结果进行证实，肺炎旁积液通过常规的化验、检查和治疗效果来诊断。进行检测前已获得所有纳入患者的知情同意。

1.3 方法 纳入的患者都需要经过相应的检查来证实含有可以进行抽取的胸腔积液，在无菌操作的原则下行胸腔穿刺的操作，并留取适当量的胸腔积液。

1.3.1 胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测:取20 ml胸腔积液进行离心，将裂解液加入到离心后的沉淀中，振荡混匀1 min，静置15 min。将处理后样本缓慢加入Xpert反应盒内(购自美国的Cepheid公司)；上机检测，在2 h后进行检测结果的读取。

1.3.2 TB-DNA检测:使用PCR-荧光探针的检测方法，对胸腔积液进行结核分枝杆菌DNA的检测，具体操作严格按照试剂盒(产自成都博奥晶芯生物科技有限公司)说明进行。

1.3.3 ADA活性检测:取新鲜的胸腔积液5 ml，以3 000 r/min的速度离心10 min，取得上清液体用酶法测定ADA活性，参照试剂盒的说明进行诊断，试剂盒购自宁波美康公司。

1.3.4 结核菌培养:采用氢氧化钠溶液对采集的胸腔积液标本反应20 min，随后加入缓冲液混匀后离心处理，去上清后加入缓冲液重悬沉淀物，混匀后取0.5 ml接种于MGIT960液体快速结核菌培养基中，并在BACTEC MGIT960快速培养系统(Becton Dickinson公司，美国)培养。具体步骤严格按照使用说明书进行。

2 结果

2.1 2组患者胸腔积液ADA检测结果 结核组胸腔积液ADA中位水平44(26，59.25)U/L，高于非结核性胸膜炎组患者的ADA中位水平11.4(6，15.75)U/L，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者胸腔积液ADA检测结果

2.2 胸腔积液ADA受试者工作特征曲线分析 受试者的工作特征(ROC)曲线的分析显示，ADA用于诊断结核性胸膜炎的ROC曲线下的面积为0.916。本研究中，胸腔积液ADA在面积最大时ROC曲线拐点值为24.5 U/L，在该临界值下，诊断的敏感性为79.5%，特异性为88%。见图1。

图1 胸腔积液ADA受试者工作特征曲线分析

2.3 胸腔积液TB-DNA、结核菌培养及GeneXpert MTB/RIF检测结果及比较 结核组与非结核组患者的胸腔积液标本均行TB-DNA、结核菌培养及GeneXpert MTB/RIF检测，结核组患者胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测阳性率(26.9%)，分别高于胸腔积液结核菌培养阳性率(16.7%)及胸腔积液TB-DNA检测的阳性率(2.6%)(χ2=2.407，P>0.05；χ2=18.41，P<0.05)。见表3。

表3 胸腔积液TB-DNA、结核菌培养及GeneXpert MTB/RIF检测结果比较

2.4 胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测结果 结核组与非结核组患者的胸腔积液均进行了GeneXpert MTB/RIF检测，其中结核组检出阳性的例数为21例，阴性例数为57例；非结核组患者检测结果均为阴性。计算胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度为26.9%，特异度为100%。

2.5 胸腔积液ADA与GeneXpert MTB/RIF并联检测价值 将胸腔积液ADA与GeneXpert MTB/RIF并联检测，结果显示胸腔积液ADA+GeneXpert MTB/RIF的敏感度(82.1%)，高于胸腔积液ADA活性检测(79.5%)及胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测(26.9%)(χ2=66.117，P<0.05；χ2=6.286，P<0.05)。见表4。

表4 胸腔积液ADA与GeneXpert MTB/RIF并联检测对结核性胸膜炎的诊断性能

3 讨论

在中国40%的胸腔积液是由结核性胸膜炎引起的，该病的临床症状不典型，可以出现发热、咳嗽、胸痛等症状，有时也可出现呼吸困难[6]。结核性胸膜炎是结核杆菌直接侵入发生的炎症或者是胸膜对结核菌的菌体相关的成分发生了迟发型的变态反应[7]，故此类患者胸腔积液中常常缺乏结核分枝杆菌，结核分枝杆菌的分离较为困难，早期确诊也十分困难。与培养、染色和活检相比，胸膜生物标志物是一种廉价、无创、快速、客观的结核性胸膜炎诊断工具[8]，如胸腔积液ADA水平检测目前应用最为广泛，但由于腺苷脱氨酶是由胸膜腔内T淋巴细胞的浸润激活的，因此较少的结核分枝杆菌可能导致较弱的免疫反应和较低的腺苷脱氨酶水平。其他因素，包括年龄和吸烟史，也可能影响ADA水平[9]。分子生物学不断的发展，为快速诊断结核病及快速检测结核菌的耐药性提出了新的方法，其中痰及肺泡灌洗液标本GeneXpert MTB/RIF研究较为广泛，其高度敏感性及特异性也得到了广泛认可，在胸腔积液标本中研究相对较少。本研究回顾性地分析了胸腔积液中ADA、TB-DNA、GeneXpert MTB/RIF诊断及鉴别结核性胸膜炎的价值。我们发现以上三种检测方法中胸腔积液ADA检测的敏感度最高，而且有着较高的特异度；胸腔积液内的TB-DNA、GeneXpert MTB/RIF的特异度高，但敏感度均较低，其中胸腔积液GeneXpert MTB/RIF法诊断结核性胸膜炎方面敏感度比胸腔积液TB-DNA检测明显要高；胸腔积液ADA与胸腔积液GeneXpert MTB/RIF并联检测可以提高诊断的敏感度。

ADA作为嘌呤核苷代谢中的酶，淋巴细胞的ADA含量相对高，患有结核性胸膜炎时，刺激免疫系统使得淋巴细胞增多，故胸腔积液中ADA含量增高。ADA水平检测对结核性胸膜炎的诊断有辅助的作用，Aggarwal等[10]评估总结了ADA诊断结核性胸膜炎中的敏感性和特异性，发现胸腔积液内ADA水平诊断结核性胸膜炎的总的敏感性、特异性是0.92(95%可信区间0.90～0.93)、0.90(95%可信区间0.88～0.91)，但由于各项研究采用的参考标准不一致，且各地区患病率的不同，故ADA诊断界值具有可变性，而无法得到可靠的ADA参考阈值。胸腔积液ADA水平的上升和其他病因也有关系，如脓胸和肺炎旁积液，使用ADA诊断可能出现假阳性结果[11]。相关研究表明，结核性胸膜炎患者也可出现低ADA活性的情况，Sae等[12]研究显示老年或危重或多器官衰竭的患者的ADA活性相对低；当艾滋病合并结核性胸膜炎时，免疫系统缺陷使得淋巴细胞的反应力下降，导致胸腔积液内的ADA水平不能得到显著上升[13]；结核性胸膜炎早期胸腔积液中ADA水平也可能处于低水平，在以上情况下使用ADA活性方法诊断可能导致假阴性诊断。本研究中，结核组胸腔积液ADA中位水平44(26,59.25)U/L，比非结核性胸膜炎组ADA中位水平11.4(6,15.75)U/L升高明显，有统计学的差异；受试者的工作特征(ROC)曲线分析显示，ADA用于结核性胸膜炎诊断的ROC曲线下的面积为0.916，对结核性胸膜炎的诊断价值较高。胸腔积液ADA在面积最大时ROC曲线拐点值为24.5U/L，以此为临界值，诊断结核性胸膜炎的敏感度为79.5%，特异度为88%。鉴于使用ADA诊断方法有可能出现假阴性和假阳性结果，临床上在制定临界值时需要根据患者年龄、免疫状态等综合考虑，而且为提高鉴别诊断的准确性，多种检测手段常常联合来诊断。

结核分枝杆菌DNA检测是一种通过聚合酶链反应(PCR)的方法来进行结核分枝杆菌基因DNA扩增，可为结核分枝杆菌感染提供直接证据，以PCR为基础的检测呼吸道标本中结核分枝杆菌DNA的技术已越来越多地应用于肺结核的诊断，然而，PCR技术的不断改进以及研究所定参考标准的不同，其在诊断准确性上也不全相同，尤其是在非呼吸道标本如胸腔积液，诊断方面使用存在很大争议。Mulalo等[2]评价实时聚合酶联反应(qPCR)和胸水腺苷脱氨酶(ADA)水平在结核性胸腔积液诊断作用的研究发现TB-PCR和ADA的敏感性分别为67%和80%；然而在Islam等[14]研究采用传统PCR检测，PCR阳性率仅6%。在我们的研究中，采用PCR-荧光探针法检测结核分枝杆菌DNA，以综合参考标准为参照，只有2名结核性胸膜炎患者的胸腔积液PCR检测结果呈阳性，诊断敏感性2.6%，特异性100%，本研究结果提示胸腔积液PCR-荧光探针法检测结核分枝杆菌DNA敏感性较差，不适合作为结核性胸膜炎常规检测方法。GeneXpert MTB/RIF是经世界卫生组织推荐的，对结核病有快速诊断价值的分子生物学的方法，以半巢式实时荧光定量聚合酶链反应为基础，全自动地检测结核分枝杆菌和利福平耐药。Li等[15]的研究显示GeneXpert MTB/RIF对肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液的敏感性为100%，其次是痰(88.5%)、肺泡灌洗(85.7%)、支气管镜分泌物(81.2%)，胸水敏感性最低，仅为15.0%，但明显高于AFB(0)。Han等[3]研究显示胸腔积液Xpert MTB/RIF法的敏感性为27.4%，明显高于胸腔积液涂片(14.3%，χ2=20.65，P≤0.001)。Sehgal等[16]对GeneXpert MTB/RIF在结核性胸腔积液(TPE)诊断中的作用进行了一项荟萃分析，发现以培养为参照物，Xpert MTB/RIF的敏感性和特异性分别为51.4%和98.6%，以CRS为参照物，分别为22.7%和99.8%。Wang等[1]研究以综合参考标准进行结核性胸膜炎诊断，结果发现GeneXpert MTB/RIF(19.23%)和涂片(1.44%)相比具有更高的敏感性。本研究以CRS为参照物，胸腔积液GeneXpert MTB/RIF检测敏感度为26.9%，特异度为100%，与上述结论较为一致。从现有研究数据来看，GeneXpert MTB/RIF诊断结核性胸膜炎的方面表现出的敏感性不够高，考虑本研究中多数的患者的胸腔积液可能是胸膜经结核菌菌体的成分刺激而发生了迟发型的变态反应，而不是结核菌直接侵入引起的，故该类患者胸腔积液中的结核分枝杆菌可能较少。本研究中胸腔积液GeneXpert MTB/RIF与胸腔积液TB-DNA诊断的特异性均为100%，相比而言，胸腔积液GeneXpert MTB/RIF具有更高的敏感性，且因其检测需要的时间短，而敏感性与结核菌培养相当，对结核性胸膜炎的诊断具有一定价值。

总之，胸腔积液ADA活性检测的敏感性(79.5%)和特异性(88%)均较好，目前仍是诊断结核性胸膜炎的有用方法。PCR-荧光探针法检测结核分枝杆菌DNA的敏感性较低，不应作为结核性胸膜炎的常规检测方法，比较而言，胸腔积液GeneXpert MTB/RIF诊断价值更高，与胸腔积液ADA活性检测相结合，可以提高诊断结核性胸膜炎的效能，在有条件的地区，GeneXpert MTB/RIF与ADA活性的测量可以同时进行。本研究也存在一些局限性，研究的样本量相对较少，采用综合参考标准而不是以胸膜液结核菌培养或胸膜组织学作为参考标准，是一项单中心的回顾性研究，可能会限制我们结果的普遍性。因此，有必要在更大的人群中进行多中心前瞻性研究，以进一步验证其诊断性能。