miR-145-5p靶向调控MRGBP基因表达对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

胡超前

白内障是一种晶状体混浊的疾病，可导致严重的视力损害或致盲[1]。白内障约占所有致盲原因的42%[2]，是全球致盲的主要原因[3]。其中，年龄相关性白内障是成年人最常见的白内障类型，与视觉和认知障碍以及抑郁症有关[4]。晶状体上皮细胞可分化为晶状体纤维，在晶状体的生物学功能中起着重要的作用。根据报道，除了先天性白内障外，晶状体上皮细胞的凋亡是所有类型白内障的细胞基础[5]，但晶状体上皮细胞凋亡的机制尚未完全阐明。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类广泛存在于动植物体内的小分子RNA，参与转录后基因调控。它们还参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程[6]。新的证据表明，miR-145-5p在各种疾病的细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和炎症中发挥着关键作用[7-9]。并且miR-145-5p的抑制可以提高高糖诱导的视网膜神经节细胞的增殖，和抑制细胞凋亡，miR-145-5p可能成为糖尿病视网膜病变的潜在靶点[10]。MRG结构域结合蛋白(MRG domain binding protein，MRGBP)在胰腺癌中高表达，其低表达可以促进细胞的凋亡，并抑制胰腺癌细胞的生长[11]。然而miR-145-5p在白内障中的作用及其是否通过靶向MRGBP调控晶状体上皮细胞增殖和凋亡目前尚未可知。因此，本研究构建晶状体上皮细胞凋亡模型，研究miR-145-5p在其中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响，并结合MRGBP对其作用机制进行探索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SRA01/04细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，DMEM培养基购自美国Gibco公司，实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)相关检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自美国Pierce公司，MRGBP抗体购自美国Santa Cruz公司，细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3/C-caspase-3)购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥公司，anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其阴性对照、荧光素酶报告载体购自广州锐博生物有限公司，异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。

1.2 细胞培养与处理 SRA01/04细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5% CO2、饱和湿润的培养箱中孵育。观察到细胞生长至80%～90%融合时，加入胰酶消化，并接种传代。建立晶状体上皮细胞凋亡模型时，参照秦宇等[12]用紫外线照射的方法进行操作，即收集对数生长期的SRA01/04细胞，置于360 μW/cm2照射强度的紫外灯下照射25 min。照射完成后，细胞于37℃、5% CO2的条件下继续培养4 h，同时将正常培养的细胞设为对照。

1.3 qPCR检测miR-145-5p、MRGBP mRNA水平 在SRA01/04细胞中加入TRIzol试剂提取总RNA，通过逆转录试剂盒制成cDNA，以cDNA为模板，利用qPCR检测试剂盒测定miR-145-5p、MRGBP mRNA表达。引物序列分别为miR-145-5p：5’-GTCCAGTTTTCCCAGG

AATC-3’(正向)，5’-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3’(反向)，MRGBP：5’-GGAGGAGACAGTGGTGTGG-3’(正向)，5’-CATGTGGAAGTGTCGGTTCA-3’(反向)，内参U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反应结束后，由2-ΔΔCt法计算miR-145-5p、MRGBP mRNA表达。

1.4 蛋白质印迹法(Western Blot)检测MRGBP蛋白表达 使用RIPA裂解液提取SRA01/04细胞中的蛋白，BCA法定量后进行10%的十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)电泳，转膜，加入5%脱脂奶粉封闭1 h，将膜与1∶1 000稀释的MRGBP一抗4℃孵育过夜，次日使用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)充分漂洗膜，与1∶5 000稀释的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗膜，加入增强化学发光液显色，以β肌动蛋白(β-actin)为参照，分析MRGBP蛋白条带。

1.5 细胞转染 将5×105个/ml密度的SRA01/04细胞接种于6孔板，细胞生长至70%融合时，利用Lipofectamine 2000试剂，在细胞中转染anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其相应阴性对照，并且依照1.2所述方法进行紫外线照射，转染48 h后，收集细胞，分别根据1.3和1.4中的方法检测miR-145-5p和MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表达。

1.6 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测细胞增殖 调整SRA01/04细胞密度为1×105个/ml，接种于96孔板，培养48 h后，每孔细胞加入20 μl MTT溶液，反应4 h，之后加入150 μl二甲基亚砜，摇床震荡反应10 min，于酶标仪读取细胞490 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞增殖率(%)。细胞增殖率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 SRA01/04细胞凋亡的检测依照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书的指示，在1×106个/ml密度的SRA01/04细胞中加入500 μl缓冲液，使细胞重悬，依次加入5 μl Annexin V-FITC、5μl PI染色液，分别混匀后于黑暗中反应15 min，置流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。

1.8 生物信息学预测与双荧光素酶活性检测 starbase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测出miR-145-5p和MRGBP的3’非编码区(3’untranslated region，3’UTR)具有靶向结合位点。构建含有miR-145-5p结合位点的MRGBP-3’UTR野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体，在SRA01/04细胞中共转染miR-145-5p和MRGBP野生型及突变型报告基因载体，48 h检测细胞双荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-145-5p和MRGBP在晶状体上皮细胞中的表达 与对照比较，凋亡模型晶状体上皮细胞SRA01/04中miR-145-5p表达量明显增加，MRGBP mRNA和MRGBP蛋白表达量显著减少(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western blot检测MRGBP蛋白表达

表1 miR-145-5p和MRGBP在晶状体上皮细胞中的表达

2.2 低表达miR-145-5p对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响 与对照比较，凋亡模型SRA01/04细胞中miR-145-5p表达量明显增加，cyclinD1表达量、细胞增殖率显著减少，C-caspase-3水平、细胞凋亡率明显提高(P<0.05)。与凋亡模型+anti-miR-NC比较，低表达miR-145-5p显著减少凋亡模型SRA01/04细胞的miR-145-5p表达量，明显增加cyclinD1表达量、细胞增殖率，以及显著降低C-caspase-3水平、细胞凋亡率(P<0.05)。见图2，表2。

图2 低表达miR-145-5p对晶状体上皮细胞凋亡及cyclinD1、C-caspase-3蛋白表达的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡;B Western blot检测cyclinD1、C-caspase-3蛋白表达

表2 低表达miR-145-5p对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

2.3 高表达MRGBP对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响 与凋亡模型+pcDNA-NC比较，高表达MRGBP明显增加凋亡模型SRA01/04细胞中MRGBP蛋白表达量、cyclinD1蛋白表达量、细胞增殖率，而显著降低C-caspase-3蛋白水平、细胞凋亡率(P<0.05)。见表3，图3。

表3 高表达MRGBP对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

图3 Western blot检测MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表达

2.4 miR-145-5p靶向调控MRGBP表达 Starbase预测发现，miR-145-5p和MRGBP的3’UTR部分碱基存在互补配对现象。相比于miR-NC和WT(MRGBP)共转染，miR-145-5p与WT(MRGBP)共转染的SRA01/04细胞荧光素酶相对活性明显降低(P<0.05)；miR-NC或miR-145-5p与MUT(MRGBP)共转染后，SRA01/04细胞荧光素酶相对活性无显著变化。与miR-NC比较，miR-145-5p组MRGBP蛋白表达量明显减少；与anti-miR-NC比较，anti-miR-145-5p组MRGBP蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表4、5，图4。

表4 miR-NC或miR-145-5p与报告质粒共转染SRA01/04细胞后双荧光素酶活性检测

表5 Western blot检测MRGBP的表达

图4 miR-145-5p靶向调控MRGBP表达;A starbase对miR-145-5p和MRGBP结合的预测示意图;B Western blot检测MRGBP表达量

2.5 低表达MRGBP可以逆转miR-145-5p低表达对晶状体上皮细胞凋亡模型增殖和凋亡的影响 与凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-NC比较，凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-MRGBP组SRA01/04细胞的MRGBP、cyclinD1蛋白表达量、细胞增殖率明显减少，C-caspase-3蛋白水平、细胞凋亡率显著提高(P<0.05)。见图5，表6。

图5 Western blot检测MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表达

表6 低表达MRGBP可以逆转miR-145-5p低表达对晶状体上皮细胞凋亡模型增殖和凋亡的影响

3 讨论

白内障仍然是导致患者视力障碍和失明的主要原因。目前，手术干预是治疗白内障的有效方法。然而，人口特点和高昂的手术费用给社会带来了巨大的经济负担，尤其是在发展中国家。此外，患者也可能发生不可逆的手术相关并发症[13]。因此，为了预防或延缓白内障的发生发展，仍需要新的治疗策略。晶状体上皮细胞在晶状体整个生命周期中负责晶状体纤维的分化。正确的晶状体上皮细胞分化和形态维持晶状体的正常透明，而晶状体上皮细胞内的发育、增殖、分化、凋亡等的病理变化可能导致白内障[14,15]。本研究以晶状体上皮细胞SRA01/04为对象，利用紫外线照射建立细胞凋亡模型，发现与对照比较，凋亡模型晶状体上皮细胞SRA01/04中细胞增殖率、cyclinD1表达量显著减少，细胞凋亡率、C-caspase-3水平明显提高，与前人报道[16,17]相符。

miRNA是一类内源性非编码RNA，通过与靶mRNA 3，UTR的互补序列结合，可以诱导其降解或翻译抑制[18]。研究表明，一些miRNA与白内障的发生有关，提示miRNA可能成为白内障诊断和治疗的新靶点[19,20]。Lu等[21]发现miR-24在年龄相关性白内障和氧化应激刺激的晶状体上皮细胞中表达显著增加，参与年龄相关性白内障形成的新机制。Chen等[22]报道了miR-26a和miR-26b可以抑制晶状体上皮细胞的增殖、迁移和晶状体的体内外纤维化。根据报道，miR-145-5p被认为具有抑癌作用，可以抑制肿瘤细胞增殖，促进癌细胞凋亡，抑制体内外肿瘤发生[23-25]。此外，miR-145-5p参与一些眼科疾病进展，在小鼠视网膜组织中，miR-145-5p表达上调，并通过下调β-连环蛋白(β-catenin)的表达影响眼轴的增长[26]。然而，miR-145-5p在白内障中的作用尚未见报道。本研究发现，miR-145-5p的生物学功能和分子机制与白内障的进展相关。与对照比较，凋亡模型晶状体上皮细胞SRA01/04中miR-145-5p表达明显上调，低表达miR-145-5p显著增加凋亡模型SRA01/04细胞的增殖率、cyclinD1表达量，显著降低细胞凋亡率、C-caspase-3水平。说明miR-145-5p影响白内障的进展，下调miR-145-5p在凋亡模型晶状体上皮细胞中表现出促进增殖和抑制凋亡的功能，与Zhang等[10]的研究相似。

本实验中，凋亡模型晶状体上皮细胞SRA01/04中MRGBP mRNA、MRGBP蛋白表达量显著减少，提示MRGBP可能在晶状体上皮细胞生物学过程中发挥重要作用。MRGBP也称为20号染色体开放阅读框20，是编码包含组蛋白乙酰转移酶复合物的转化/转录域相关蛋白(TRRAP)/tat相互作用蛋白60(TIP60)的一个亚基[27]。MRGBP已被证明在肺肿瘤组织中异常升高[28]，通过发挥其在细胞增殖和(或)癌细胞分裂方面的优势而促进结直肠癌的发生[27]。然而MRGBP对白内障的影响尚不清楚。本研究的功能实验结果显示，高表达MRGBP显著增加凋亡模型SRA01/04细胞的增殖率、cyclinD1表达量，明显降低细胞凋亡率、C-caspase-3水平。表明MRGBP对凋亡模型晶状体上皮细胞具有一定的保护作用，可以促进细胞增殖并诱导凋亡。生物信息学数据库用于预测miR-145-5p在MRGBP 3，UTR中的可能结合位点。进一步的实验表明，miR-145-5p可直接靶向MRGBP的3，UTR并降低其表达。同时，低表达MRGBP可以逆转miR-145-5p低表达促进凋亡模型中SRA01/04细胞增殖、cyclinD1蛋白表达的作用，以及逆转了其抑制细胞凋亡、C-caspase-3蛋白表达的作用。这些结果证实，miR-145-5p对凋亡模型晶状体上皮细胞的增殖和凋亡的影响可能是通过靶向调控MRGBP的表达来实现的。

综上所述，miR-145-5p在凋亡模型晶状体上皮细胞中表达明显上调，低表达miR-145-5p能够促进细胞增殖，和抑制细胞凋亡，其作用机制与靶向调控MRGBP的表达有关，为白内障的临床诊治提供了新的见解。