DLC-1、PCDH10表达水平和NQO1基因多态性与吸烟诱导胃癌ESD术后复发的关系

张敏 周晓晴 李保华 罗超 唐侨

胃癌是发病率和病死率均较高的消化道恶性肿瘤之一，其发生机制比较复杂，遗传因素、环境饮食因素、幽门螺杆菌感染等癌前病变以及吸烟等不良生活习惯均是胃癌发生的诱因[1]。目前临床上常采用内镜黏膜下剥离术(endoscopic submu-cosal dissection，ESD)治疗早期胃癌，该治疗方法是一种微创术，具有术后恢复快以及临床效果较佳等优势，但研究显示仍有部分患者会发生术后复发[2]。近来很多研究证实人体内多种基因均参与了胃癌发生发展历程，有学者们报道DLC-1蛋白对于癌细胞生长和转移具有明显抑制作用[3]。编码原钙黏蛋白10(protocadherin-10，PCDH10)作为多种恶性肿瘤的预测标志物之一，该基因甲基化过程与胃癌进程存在紧密联系，且PCDH10甲基化水平与肿瘤不良预后具有显著相关性。但目前临床上尚未完全揭示DLC-1和PCDH10表达水平对于胃癌患者预后的影响作用[4]。NQO1作为肿瘤易感基因，该基因突变会增加胃癌发生风险；而吸烟作为多种肿瘤的独立危险因素已被证实，有研究报道吸烟与NQO1多态性存在交互作用，二者会共同促进诱导胃癌发生和进展[5]。本文将探讨DLC-1、PCDH10表达水平和NQO1基因多态性与吸烟诱导胃癌ESD术后复发的关系，旨在为胃癌复发预防和控制提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性的选取2015年1月至2018年1月在四川省仪陇县人民医院进行ESD术的202例胃癌患者作为研究对象，其中男128例(63.37%)，女74例(36.63%)；年龄38～78岁，平均年龄(58.69±6.87)岁。根据患者患胃癌前是否吸烟分为吸烟组(n=102)和不吸烟组(n=100)。吸烟的定义标准为：每天吸烟1支及以上，吸烟时间持续半年以上。102例吸烟患者每天的人均吸烟量为(5.65±1.02)支，吸烟时间为8个月～10年，平均吸烟时间为(5.36±0.53)年。2组患者年龄、性别比、肿瘤病理学分型等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。根据患者行胃癌ESD术后1年内的复发情况分为复发组和未复发组(术后每3个月对患者随访1次，随访时间为1年，终点事件包括复发或死亡)。所有患者签署知情同意书，本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准[6]：①患者均经病理切片确诊为胃癌，且满足ESD术治疗适应症并进行ESD术治疗者；②未接受放化疗或靶向治疗者；③自愿并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①合并心肾功能不全、重度高血压等严重疾病者；②患有严重内外科疾病或传染病者；③既往接受过胃癌切除术或放疗、化疗者；④患有严重精神疾病者；⑤无法接受或完成随访者。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集:全面收集所有研究对象的临床资料，包括性别、年龄、病理类型以及临床分期等资料。

1.3.2 DLC-1蛋白表达检测:采用SP法检测胃癌和癌旁组织以及正常胃组织的DLC-1表达：使用抗体及试剂盒为浓缩型DLC-1兔抗人单克隆抗体(购自GENE TEX)和DAB显色试剂盒和SP试剂盒(购自默沙克生物)，将ESD手术过程中，于胃窦部位采集患者胃癌组织(距肿瘤中心<1 cm)、癌旁组织(距肿瘤中心<3 cm的边缘)以及正常胃组织(距离肿瘤中心>5 cm)，石蜡包埋后制备成厚度为2 μm切片，然后使用枸橼酸盐缓冲液(0.01 mol/L)经过微波处理后修复抗原，于室温下孵育DLC-1抗体30 min。结果判断标准[7]：DLC-1免疫反应主要发生在胞质内，反应物颜色呈棕黄色。染色强度分为4级，分别为0～3分。分别代表无阳性染色(0分)、浅黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。着色范围分为4级(Ⅰ～Ⅳ级)：其中Ⅰ级表示无阳性细胞染色(0分)，Ⅱ级表示阳性细胞率<25%(1分)，Ⅲ级表示阳性细胞率范围为26%～50%(2分)，Ⅳ级表示阳性细胞率>51%(3分)。在高倍镜视野内随机选取100个细胞，计算阳性率，连续观察5次求平均值。染色结果=染色强度×染色：阴性(-)、阳性(+)、中度阳性(+)以及强阳性(++)分别得分为0分、1～2分、3～6分和7～9分。本文判断总结果标准为≤2分判定为阴性，>2分判定为阳性。

1.3.3 PCDH10 RNA表达水平测定:采用TRIzol法使用总RNA提取试剂盒(购于赛默飞世尔中国公司)提取所有患者胃癌和癌旁组织中的总RNA ，使用紫外分光光度计(UV)测定提取出的总RNA浓度，样品A260/A280≥1．80视为合格。然后采用逆转录试剂盒(购于赛默飞世尔中国公司)将总RNA进行逆转录，分别得到模板单链cDNA，然后使PCR试剂盒以对cDNA进行PCR。 PCR设置的PCR反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 40 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s；连续循环40次，然后采用2-ΔΔct分别计算PCDH10 RNA相对表达量(RQ)[8]。结果判断标准：低表达组：≤0.5；高表达组：≥2；无显著差异组：0.5～2。

1.3.4 NQOlC609T基因分型:引物F和R分别为：5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’；5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’。PCR反应条件：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，循环30次后70℃延伸10 min。使用PCR对DNA模板扩增后生成212 bp片段，NQO1基因CC只可见212 bp，TT和CT基因型发生C→T基因突变后分别可见83和129 bp、83、129以及212 bp 条带，且CC基因型不存在Hinf I酶切位点，TT基因出现HinfI酶切位点。

2 结果

2.1 2组患者组织DLC-1表达情况比较 吸烟组患者DLC-1阳性表达比例显著低于不吸烟组患者(P<0.05)。另外染色结果表明：DLC-1在正常胃组织、癌旁组织和癌组织中表达水平分别呈现高表达、中表达、低表达，免疫反应性逐渐减弱。见表1，图1。

图1 DLC-1在正常胃组织(A)、癌旁组织(B)和胃癌组织(C)中的免疫组织化学染色图(×200)

2.2 2组患者血清PCDH10 mRNA表达量比较 吸烟组患者PCDH10 mRNA表达量显著高于不吸烟组(P<0.05)，且2组患者胃癌组织PCDH10 mRNA表达量显著高于癌旁组织(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者血清PCDH10 mRNA表达量比较

2.3 NQO1基因多态性与吸烟胃癌患者Logistic回归分析 Logistic回归分析结果显示NQO1基因多态性与吸烟胃癌患者之间存在密切相关性(P<0.05)。吸烟组胃癌患者携带NQO1CT和TT基因型的概率明显高于不吸烟组(P<0.05)。见表3。

表3 NQO1基因多态性与吸烟胃癌患者Logistic回归分析

2.4 胃癌患者ESD术后复发影响因素分析 随访1年后失访患者6例(死亡1例，随访资料不完整5例)，共有196例患者纳入研究分析。其中65例患者胃癌复发，131例患者未复发。分析结果显示：ESD术后是否发生胃癌复发与患者性别、年龄、病理类型以及分期无显著关系(P>0.05)；而术后发生胃癌复发患者DCL-1阴性、胃癌组织PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因CT和TT型比例均显著高于未复发组患者(P<0.05)。见表4。

表4 胃癌患者ESD术后复发影响因素分析 例

2.5 影响胃癌患者ESD术后复发的多因素分析 将表5中对于胃癌患者ESD术后复发具有统计学意义的影响因素进行Logistic回归分析，发现DCL-1阴性率、胃癌组织PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因多态性均与胃癌患者ESD术后复发存在密切相关性(P<0.05)。见表5。

表5 影响胃癌患者ESD术后复发的多因素分析

3 讨论

胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和病死率均较高，且目前我国胃癌发病人数呈逐渐上升和年轻化趋势，对患者健康造成严重威胁[9]。ESD作为目前临床上治疗胃癌的微创手术，其相比传统开放性术式具有创伤更小、患者恢复时间短等优势，深受患者和医生欢迎，但部分患者在行ESD术后发生复发仍是一个不容忽视的问题[10]。吸烟作为肿瘤常见危险因素和影响肿瘤预后的独立因素，近来有研究证实吸烟与多种肿瘤易感基因多态性存在交互效应，即吸烟等危险环境因素会放大基因突变对肿瘤发生发展的影响[11]。

NQO1是人体内较为重要的Ⅱ相反应酶之一，可以通过促进还原反应发生减轻醌类等有害化合物对机体细胞的致癌致畸作用。已有的研究证实，NQO1基因存在多态性，且突变型基因(CT或TT)形成的蛋白产物稳定性不佳，会快速发生降解，且若其为纯合突变基因型(TT)则稳定性更差[12]。陈道俊等[13]研究结果表明NQO1基因多态性与吸烟存在交互作用，且发生纯合突变的NQO1 TT1型者吸烟对胃癌的影响效应更加严重。本文研究结果显示，NQO1基因多态性与吸烟胃癌患者之间存在密切相关性(P<0.05)。吸烟组胃癌患者携带NQ01CT和TT基因型的概率明显高于不吸烟组患者，差异有统计学意义(P<0.05)。且预后研究结果显示术后发生胃癌复发患者的NQO1基因CT和TT型比例均显著高于未复发组患者(P<0.05)，NQO1基因多态性均与胃癌患者ESD术后复发存在密切相关性(P<0.05)。推测原因主要是由于NQOI CT、TT基因型属于胃癌易感基因类型，该基因型携带者本身发生胃癌风险相对于CC型更高，而吸烟作为诱导因素，可能会促进NQO1 基因发生CT或TT基因突变，且发生突变后其与对基因突变的交互作用会进一步影响和加剧胃癌的发生发展，从而影响患者预后和术后复发情况[14]。

肿瘤发生的重要机制是机体癌基因激活和抑癌基因失活之间的平衡被打破。DLC-1是表达于人体正常组织中的一种抑癌基因；有研究证实，DLC-1在多种肿瘤组织中表现为低表达甚至缺失[4]。本研究结果表明，吸烟组患者DLC-1阳性表达患者比例显著低于不吸烟组患者，二者差异有统计学意义(P<0.05)。且DLC-1在正常胃组织、癌旁组织和癌组织中表达水平分别呈现高表达、中表达、低表达，免疫反应性逐渐减弱。且预后研究Logistic回归分析发现DCL-1阴性与胃癌患者ESD术后复发存在密切相关性(P<0.05)。黄永平等[15]研究结果说明DLC-1表达水平与肿瘤分期和恶性程度存在密切联系，一般DLC-1阴性表达者恶性程度更高。而肿瘤N分期、LNR作为肿瘤预后重要判断指标，会严重影响肿瘤预后。同时有研究表明DLC-1 mRNA虽然也会在正常组织中表达，但启动子区域不会发生无甲基化，而DLC-1 mRNA 在胃癌组织中表现为低表达甚至不表达，且甲基化陈程度高达35%左右[11]。说明DLC-1 mRNA 表达量与DLC-1启动子的过度甲基化程度存在显著负相关性[16]。Sotillos等[17]研究进一步表明启动子区域高甲基化可能会增加多种癌细胞如结直肠癌、肝癌以及胃癌等DLC-1基因失活的概率。以上研究均说明了DLC-1在各类癌组织中更倾向于阴性表达，而吸烟作为胃癌独立危险因素，可能是通过诱导DLC-1启动子区域甲基化加剧了DLC-1mRNA阴性表达，从而对患者预后造成不良影响。

PC-DH10作为恶性肿瘤相关基因之一，其在多种恶性肿瘤发展进程中可以发挥抑制癌细胞侵袭和转移作用。刘培根[18]研究报道PC-DH10基因的启动子区域会发生过度甲基化现象，而肿瘤发生增殖时，启动子区域的过度甲基化会促进 miRNA转录。本文研究结果显示吸烟组患者PCDH10 mRNA表达量显著高于不吸烟组(P<0.05)，且2组患者胃癌组织PC-DH10 mRNA表达量显著高于癌旁组织(P<0.05)；Logistic回归分析发现胃癌组织PC-DH10 mRNA水平与胃癌患者ESD术后复发存在显著相关性(P<0.05)。而林莹等[19]研究结果显示胃癌病灶内PCDH10的mRNA表达水平反而低于癌旁组织。Shishodia等[20]研究表明乳腺癌患者中乳腺癌组织的PCDH家族中的PCDH7基因表达水平显著高于正常患者和癌旁组织。说明关于PC-DH10对于肿瘤发生发展作用机制尚未完全揭示，其与肿瘤预后之间的关系需要进一步深入研究证实，且PC-DH10家族中各亚型基因对肿瘤作用机制可能不完全相同。

综上所述，NQOI基因多态性、DLC-1阴性和PCDH10高表达以及吸烟会增加胃癌的发生风险，且DLC-1阴性与胃癌ESD术后复发存在显著负相关，PCDH10表达水平和NQO1基因多态性及吸烟与胃癌ESD术后复发存在显著正相关。