基于分子对接技术的飞龙掌血抗炎活性生物碱筛选及其作用机制*

罗才荣, 刘杰, 梁妍, 盛钰, 何芋岐, 周威*

(1.贵州医科大学 药学院, 贵州 贵阳 550025; 2.遵义医科大学 药学院, 贵州 遵义 563099)

飞龙掌血[Toddaliaasiatica(L.) Lam.]为芸香科、飞龙掌属植物，传统中医认为该药具有止血、散瘀、止痛和祛风的功效[1-2]，本课题组前期研究发现飞龙掌血总生物碱具有显著抗炎镇痛作用[3]。鉴于炎症与癌症、糖尿病及哮喘等诸多疾病密切相关[4-7]，开展抗炎药物研究就显得尤为重要。核转录因子κB(nuclear factor kappa beta,NF-κB)可以介导炎症发生的各个阶段，它通过调控炎症基因表达来调节炎症反应；IκB激酶β(IκB kinase β, IKK-β)是抑制NF-κB通路的关键激酶，当IKK-β被激活产生联级反应导致NF-κB被异常激活，可产生大量的炎症因子；丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)具有与IKK-β相似的作用；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase, iNOS)、环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX-2)都是NF-κB调节的基因[8-10]。TNF-α可以反向的作用于NF-κB形成正反馈调节，当TNF-α 被抑制后可以减轻炎症条件下产生的疼痛[8]；iNOS是一种细胞间信使，通过NF-κB刺激上调COX-2和iNOS增加细胞因子的表达，激活中枢和外周疼痛[10]；巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibition factor, MIF)是炎症反应中上游的介质，参与调节促炎介质产生[11]；这些抗炎因子受体是炎症研究中重要的研究对象[12-15]。分子对接技术属于计算机辅助药物设计(computer-aided drug design, CADD)的重要组成部分，分子对接是将配体小分子放到受体活性口袋中，通过变化配体小分子的空间构象，按照几何、能量及化学环境互补的原则来评价配体小分子与受体互相作用的强弱, 预测其结合模式、亲和力的方法[16]。结合课题组前期研究基础[3]，本研究通过计算机虚拟筛选手段进一步丰富飞龙掌血抗炎活性生物碱，并分析其可能的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1平台和软件 本研究所有的操作均在Windows操作系统中完成的，化学结构绘图软件，分子对接软件。软件中参数设置未说明，均为默认值。

1.1.2靶点、上市药物和候选化合物 选取7个与炎症相关的靶点蛋白，即NF-κB1、IKK-β、p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)、TNF-α、MIF、iNOS及COX-2。从RCSB PDB数据库(www.rcsb.org)搜索并下载对应的晶体蛋白结构，蛋白数据库(protein data bank, PDB)编号及原配体与靶点残基作用情况(表1)。在DrugBank数据库(www.drugbank.ca)检索到12个对上述靶点有抑制作用并己批准上市的小分子药物(表 2)，下载其化合物结构。从本课题组对飞龙掌血的综述[17]及现有报道中得到65个生物碱化合物，通过PubChem化合物数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载其3D构象。

表1 原配体与靶点残基作用情况

表2 与靶点有抑制作用的已上市小分子药物

1.2 方法

1.2.1靶点蛋白的处理 在分子对接软件中对所有的蛋白进行前处理，即删除水分子、原配体分子及其非相关的蛋白质构象，经Clean Protein、Preare Protein工具等处理。定义蛋白为受体，并将其定义sphere球，最后保存备用。

1.2.2类药五规则(Lipinski)[18]筛选候选化合物 使用Lipinski对候选的65个飞龙掌血生物碱类化合物进行筛选，包括：(1)分子量<500;(2)氢键给体数目<5;(3)氢键受体数目<10;(4)脂水分配系数<5;(5)可旋转键的数量<10。

1.2.3候选化合物和上市药物的处理 将符合类药性原则的化合物构建出其3D构象并导入分子对接软件中进行加氢、Prepare ligands处理，最后进行能量优化，保存备用。上市小分子药物与候选的生物碱类小分子同法处理，保存作为参照配体库。

1.2.4对接方法可行性验证 将蛋白晶体中的原配体抽离，然后按设定的参数对接回原口袋，计算对接后的构象与原配体的均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)，通过RMSD值测定该对接方法和参数的可行性。

1.2.5候选化合物与靶点蛋白对接 将备用的靶点和配体分子导入分子对接软件中，使用分子对接软件中的Libdock组件，设置参数Conformation Method为FAST，Docking Preferences为High Quality，运行。同法操作，将已上市的药物小分子与靶点对接。靶点1A9U的空间坐标位置为8.429 6、12.819 7及31.194 7，靶点1LJT的空间坐标位置为-33.160 0、33.626 7及-4.868 9，靶点2AZ5的空间坐标位置为-17.423 3、73.104 4及36.976 9，靶点3RZF的空间坐标位置为96.425 7、-28.150 7及55.284 6，靶点3HR4的空间坐标位置为-0.278 4、12.720 3及-70.238 8，靶点1AM4的空间坐标位置为45.669 8、-50.205 1及8.194 6，靶点3KRK的空间坐标位置为31.666 1、35.605 0及65.043 3。对接完成后，以各靶点对应上市药物最低评分做第1次筛选，然后把筛选出的小分子配体与原配体的最低评分做2次筛选，保留高于双阈值配体，并删除重复项。

2 结果

2.1 符合Lipinski的化合物

使用Lipinski筛选后得到19个符合条件的生物碱类小分子化合物。

2.2 对接方法的可行性

在7个靶点的可行性验证结果中，得到对接后构象与原配体结构的RMSD值均小于2×10-10m，且对接构象与原配体叠合图大致重合，说明该方法的对接参数设定具有可行性(表3)。

表3 靶点蛋白与其原配体对接结果

2.3 候选化合物-靶点对接分析

将19生物碱类候选化合物进行分子对接，最终筛选出对接评分高于对各靶点有抑制作用药物及其原配体最低得分值的化合物共28个，删除重复项后最终得到14个小分子化合物见表4，表中列出19个候选化合物与不同靶点的对接打分情况。高于阈值的化合物与靶点作用情况如下：Demethylnitidine (Cp.15)作用于MIF、NF-κB1和COX-2靶点，以该化合物为例展示其与靶点的作用模式图(图 1)；1, 3-二环己基(Cp.06)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶点；N-反式-阿魏酰酪胺(Cp.10)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶点；(7Z)-N-(4′-methoxyphenethyl)-3-methoxy-4-hydrox ycinnamamide (Cp.12)作用于IKK-β、MAPK和MIF靶点；5-甲氧基白藓碱(Cp.08)作用于IKK-β、COX-2靶点；光叶花椒碱(Cp.13)作用于MIF、iNOS和NF-κB1靶点；飞龙掌血喹啉(Cp.19)作用于TNF-α和MIF靶点，木兰花碱(Cp.16)作用于IKK-β和COX-2靶点；白屈菜红碱(Cp.03)作用于TNF-α靶点，N,N′-二环己基草酰胺(Cp.11)作用于MAPK靶点；γ-崖椒碱(Cp.05)、4-甲氧基-1-甲基-2-喹诺酮(Cp.09)、弗林德碱(Cp.01)和花椒喹诺酮(Cp.14)作用于IKK-β。

表4 原配体和19个生物碱类候选化合物得分

注：A为配体分子与受体蛋白对接空腔氢键作用，紫、绿色分别表示氢键供体和受体；B为配体分子与氨基酸残基作用模式，绿色表示氢键连接的氨基酸残基，浅绿色表示范德华力连接的氨基酸残基，浅紫色表示π-烷基键连接的氨基酸残基。

2.4 候选化合物与上市药物，原配体的氨基酸残基对接分析

分析上市药物分子与各靶点间氢键和π相互作用(表5)及14个生物碱类小分子-靶点之间的氢键与π相互作用、对接方式和模式(表6)，该表展示了候选化合物-靶点-上市药物之间氨基酸残基的作用模式和作用数目，用以揭示药物分子发挥抗炎的效果时可能结合的氨基酸位点。通过化合物与上市药物对靶点共同作用的氢键、π相互作用的多寡及方式，进一步推断其可能的抗炎作用机制。

表5 已上市药物与各靶点残基作用情况

表6 筛选出的化合物与各靶点残基作用情况

3 讨论

分子对接技术在药效成分-药理靶点作用方面具有显著的技术优势，能够较准确的阐明待筛药物可能的药效与药理作用机制，已经逐渐被广泛运用于药物分子设计、蛋白质模型构建、中药药效成分的发现与新药研究开发、复杂药物药理作用机制研究中[19-22]。Lipinski是基于化学结构模拟其在体内的吸收效率及药用性能的法则，能较为快速地筛选出天然产物中具有良好成药性的药物分子[18]。

本次研究基于Lipinski，采用高通量筛选方法LibDock对接模式对飞龙掌血生物碱类化合物进行抗炎活性筛选，从65个飞龙掌血生物碱类化合物中，筛选到19个符合类药性原则的候选化合物，提示它们具有良好的成药性。但Lipinski有其自身的局限性，限定了分子量不符合该规则但可能具有良好药理活性小分子。本研究旨在通过计算机虚拟筛选手段发现飞龙掌血生物碱中抗炎活性与吸收均良好的天然化合物，对飞龙掌血生物碱类化合物进行类药性筛选。整理原配体、上市药物和候选化合物与靶点的氨基酸作用情况，分析靶点中关键氨基酸与配体之间相互作用的相似性。

可行性验证中的RMSD值是衡量靶点蛋白能否进行分子对接的重要指标，该值能反应出二次对接的配体与原配体之间的重复性，一般认为当RMSD<2×10-10m时，认为该方法具有可行性[16]。本次对接的RMSD<2×10-10m，说明本次对接中设置参数具有可操作性。

Demethylnitidine (Cp.15)可与MIF、NF-κB1和COX-2靶点产生较强的作用，其与上市药物-靶点的对接结果显示在B(Tyr385)、C(Arg85)及F(Thr558)等氨基酸残基形成相似的氢键作用，在A(Phe348)残基出形成π相互作用。

N-反式-阿魏酰酪胺 (Cp.10)可与IKK-β、MAPK和COX-2靶点发生作用，与上市药物-靶点对接中在A(Arg31、Lys44、Asp166、Leu167、Leu75、Leu87及Asp88等)残基上形成共同的氢键；其中氨基酸残基Arg31与原配体残基对接一致。周鹏等[23]在研究甘草素、甘草苷和甘草酸与IKK-β靶点对接中发现Asp166可能是该靶点的活性位点。郑新恒等[24]将分离得到的N-反式-阿魏酰酪胺进行抑制NO生成的研究，发现其抑制NO生成无明显作用，IC50值为33.15 μmol/L，大于阳性对照药槲皮素(IC50=17.21 μmol/L)。

光叶花椒碱(Cp.13)与上市药物和靶点MIF、iNOS及NF-κB的对接中在A(Lys549、Gly594及Ser628)、B(Ser60)、C(Cys59、Arg85)及F(Thr558)等氨基酸残基有相同的氢键作用；与原配体形成A(Thr547、Glu661、Thr592)共同的氢键残基，且与上市药物和原配体在Tyr631产生相同的π相互作用，表明筛选出的化合物可能具有与上市药物相似的抗炎活性。

白屈菜红碱(Cp.03)与靶点TNF-α对接结果并未表现出与氨基酸的相互作用，但Li等[25]对白屈菜红碱作用于腹膜炎症介质的研究表明其对TNF-α分泌具有极强的抑制作用。Banbury等[26]研究表明弗林德碱(Cp.01)能够抑制钙离子载体刺激的3T3中PGE2的合成，其中PGE2被认为是主要的促炎前列腺素，而中枢神经系统非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)也是通过该途径发挥作用。

综上所述，本研究从飞龙掌血中筛选出14个可能具有抗炎活性的生物碱类化合物，推测这14个化合物可能是飞龙掌血生物碱发挥抗炎活性的关键活性成分；其中有8个化合物至少与2个以上的蛋白具有良好的对接效果，说明这8个化合物具有多靶向效应，可能通过作用于多个靶点发挥抗炎的作用；靶点IKK-β、MAPK、MIF及COX-2与这14个化合物对接中高于阈值的化合物有13个，表明上述靶点可能是飞龙掌血生物碱发挥抗炎作用的重要靶点；弗林德碱、白屈菜红碱被报道具有显著抗炎作用，而N-反式-阿魏酰酪胺对抑制一氧化氮合酶的生成无明显作用，证明了该化合物与iNOS靶点蛋白(3HR4)对接打分低的原因。本次研究初步探索了飞龙掌血生物碱类化合物可能发挥抗炎作用的机制，这对于飞龙掌血生物碱类化合物抗炎作用的进一步研究和开发提供了必要的理论依据。