对乙酰氨基酚-腺苷蛋氨酸复方制剂对大鼠慢性肝损伤的作用*

陈思忆， 王铭菊， 汤磊， 陈俊， 黄家宇*

(1.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550000； 2.贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心， 贵州 贵阳 550000)

对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一种广泛使用的非处方解热镇痛药，常用剂量治疗时间为3 d，最多不超过7 d，过量服用或超期服用可致药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)，甚至肝衰竭及死亡[1-4]。故开发出一种APAP的复方制剂，超期或误服APAP的情况下能保护肝脏不受到损伤，对提高APAP的应用范围和使用中的安全性显得尤为重要。腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methionine，SAMe)是人体内一种重要的辅酶，可作为生物代谢甲基供体、硫基供体及转氨丙基供体，参与体内许多重要的生化反应，补充外源性SAMe对APAP所致的药物性肝损伤有较好的治疗作用[5-8]。目前国内外关于APAP所致大鼠肝损伤保护作用的研究多以急性肝损伤的研究为主，而对于慢性肝损伤保护作用的研究较少[9-11]。因此，研究不同剂量APAP-SAMe复方制剂在长期给药条件下对大鼠肝损伤的保护作用，对提升APAP的应用安全性具有重要的现实意义，同时也为开发一种APAP低毒性的复方制剂提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 雄性健康Sprague Dawley(SD)大鼠，specific pathogen free(SPF)级，体质量180～220 g，实验动物均购自学校实验动物中心[SYXK(黔)2018-0001]。大鼠饲养于恒温、恒湿环境中，温度23～25 ℃，相对湿度(55±5)%，自由进食饮水，适应性喂养7 d后进行实验。

1.1.2主要仪器 高速冷冻离心机(湖南可成仪器)，OSE-Y30组织研磨器(北京天根生化)，VARIOSKANLUX多功能酶标仪(美国Themo Fisher Scientific )，AUY120分析天平和UV2700紫外可见分光光度计(日本岛津)，微量移液器(德国Eppendorf)。

1.1.3主要药物与试剂 APAP及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC；源叶生物)，SAMe(西安四季生物)，天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBiL)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(南京建成生物)，10%中性甲醛固定液(成都里来生物)。

1.2 方法

1.2.1给药和分组 SD雄性大鼠60只随机均分为正常对照组(生理盐水灌胃)、APAP组(210 mg/kg APAP)、低剂量APAP+SAMe组(210 mg/kg APAP+53 mg/kg SAMe)、中剂量APAP+SAMe组(210 mg/kg APAP+105 mg/kg SAMe)、高剂量APAP+SAMe组(210 mg/kg APAP+210 mg/kgSAMe)及阳性对照组(210 mg/kg APAP+200 mg/kg NAC)，APAP的给药剂量根据临床每日最大剂量换算，SAMe低剂量组为成人等效剂量；正常对照组灌胃生理盐水，各组给予相应药物灌胃1次/d，连续30 d，

1.2.2一般情况观察 观察灌胃期间的各组大鼠的精神状态、行为活动、饮食情况、二便情况及皮肤毛色等。

1.2.3血清指标检测 各组大鼠在末次给药16 h后，按照0.35 g/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取全血置洁净试管，静置1 h，4 000 r/min离心10 min，分离血清，利用多功能酶标仪测定血清中ALT、AST、LDH及TBiL的含量。

1.2.4肝脏称重 取“1.2.3”项下各组大鼠肝脏，4 ℃生理盐水清洗，滤纸吸干水分、称重，计算肝脏指数[肝脏指数(%)=肝脏质量(g)/大鼠体质量(g)×100%]。

1.2.5肝组织病理形态学观察 取“1.2.4”项下大鼠肝脏组织，置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，常规脱水，石蜡包埋，制备切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，于400倍光学显微镜下观察各组大鼠肝组织的病理形态学特征，包括炎性细胞浸润，肝小叶肝索排列，肝细胞坏死等情况。

1.2.6肝组织GSH、SOD及MDA的测定 取“1.2.4”项下大鼠肝脏组织称重，按照质量(g) ∶体积(mL)为1 ∶9的比例加4℃的0.9%生理盐水，组织匀浆机10 000 r/min冰浴中研磨制备10%肝匀浆液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，严格按照试剂盒说明书使用半自动生化分析仪测定大鼠肝组织中GSH、SOD及MDA含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

实验期间，正常对照组大鼠毛发滑顺，有光泽，精神状态良好，行动灵活，二便正常；APAP组大鼠体质量减轻，毛发无光泽，精神状态欠佳，喜卧；相比于APAP组，SAMe给药组和阳性对照组大鼠在毛发光泽度、精神状态、体质量情况以及行动灵活性情况有不同程度的改善。

2.2 血清ALT、AST、TBiL及LDH

结果显示，与正常对照组相比，APAP组大鼠血清中ALT、AST、TBiL及LDH活力均明显升高(P<0.01)，证明长期服用APAP对大鼠造成了肝损伤；与APAP组比较，除低剂量SAMe组大鼠血清TBiL外(P>0.05)，SAMe不同给药剂量组可降低血清中ALT、AST、LDH的活力(P<0.01或P<0.05)。见图1。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；与APAP组比较，(2)P<0.05，(3)P<0.01。

2.3 肝组织GSH、SOD、MDA及肝脏指数

结果显示，与正常对照组相比，APAP组大鼠肝组织中MDA水平明显增加，GSH、SOD活性明显降低，肝脏指数明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，证明长期服用APAP对大鼠造成了肝损伤；与APAP组相比，除低剂量SAMe组大鼠肝组织GSH、MDA外(P>0.05)，不同给药剂量组均能升高SOD与GSH活力，降低MDA水平，使肝脏指数趋于正常，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见图2。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.01；与APAP组比较，(2)P<0.01，(3)P<0.05。

2.4 大鼠肝脏组织学变化

正常对照组大鼠肝脏表面光滑、颜色暗红，镜下观察肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，结构清晰可辨；APAP组大鼠肝脏肿大，有大量点状出血，镜下可见细胞核破裂，肝细胞坏死，炎性细胞浸润，肝小叶肝索不规则排列；与APAP组比较，低剂量SAMe组大鼠肝组织仍能看到多个坏死灶，大部分炎细胞浸润；中剂量SAMe组大鼠肝组织在电镜下观察到大片坏死明显减轻，间质内仍可见炎性细胞的浸润；阳性对照组及高剂量SAMe组大鼠肝细胞部分变性，无明显带状坏死，可见少量炎性细胞；各组大鼠肝脏组织炎症恢复程度大小依次表现为阳性对照组及高剂量组>中剂量组>低剂量组。见图3。

注：A～F分别为正常对照组、APAP组、SAMe低剂量组、SAMe中剂量组、SAMe高剂量组及阳性对照组。

3 讨论

APAP常用剂量一般小于2 g/d，成人最大推荐剂量为4 g/d，若超期或超剂量服用可致肝损伤[12-13]。短期内摄入正常剂量的APAP时，其90%～95%在肝脏内与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合形成无毒性物质，经肾脏排泄[14]。其中约5%的APAP经细胞色素P450代谢产生有毒的NAPQI，肝细胞内GSH结合可解毒。当长期或过量摄入APAP时，GSH耗竭，NAPQI与肝细胞内的蛋白共价结合，从而导致肝细胞坏死[15]。SAMe的转甲基作用促进肝细胞膜磷脂甲基化，增强细胞膜的流动性，抑制胆汁酸的淤积[16-17]；转巯基作用能生成半胱氨酸和GSH等内源性解毒剂，可与有毒物质NAPQI结合，在肝细胞解毒过程中发挥着重要作用[18]。APAP产生ROS、谷胱甘肽耗竭及过氧化脂质的能力被认为是导致肝损伤的主要原因[19-23]。GSH、SOD和MDA三个指标的测定常配合使用，用于评价机体氧化应激和抗氧化应激系统平衡，或在失衡后造成的氧化损伤状态。

在肝损伤模型的动物性别选择上，路燕等[24]通过比较不同性别的小鼠对于肝损伤敏感性的差异，结果发现，雄性小鼠在APAP给药后，血清ALT水平升高更明显;肝脏病理损伤更严重;肝细胞氧化损伤更严重，表明雄性小鼠相较于雌性小鼠APAP肝脏损伤更严重，同时结合本研究的实验设计，故参考相关文献选用了雄性大鼠进行肝损伤模型的建立。

本研究以APAP(210 mg/kg)配伍不同剂量SAMe(53、105及210 mg/kg)，APAP剂量210 mg/kg是由临床成人每日最大剂量换算而得，SAMe低剂量53 mg/kg是临床成人等效剂量，中剂量105 mg/kg是等效剂量的2倍，高剂量210 mg/kg是等效剂量的4倍，不同给药剂量是为找到制备复方制剂最合适的配比。结果显示，当长期摄入APAP后，大鼠肝脏受到严重损害，血清中ALT、AST、TBiL及LDH水平明显升高，肝脏中MDA含量升高，SOD和GSH活性降低；肉眼可见肝脏明显肿大，病理学切片在光镜下有明显炎性细胞浸润和肝细胞坏死，肝脏指数显著升高；配伍SAMe使用后，大鼠肝损伤得到不同程度减轻；低剂量SAMe组较APAP组的ALT、AST及LDH活力降低，SOD活力升高，TBiL、GSH及MDA差异无统计学意义(P>0.05)，且病理学切片仍有多个坏死灶，炎细胞浸润明显，但肝脏指数趋于正常，说明低剂量SAMe对APAP所致的肝损伤有拮抗作用，但差异无统计学意义(P>0.05)；中剂量SAMe组大鼠各项指标和肝脏指数与APAP组相比差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，但病理学切片在光镜下仍有部分坏死，炎性细胞浸润；高剂量SAMe能明显降低大鼠血清ALT、AST、TBiL、LDH和肝组织MDA水平，明显增加肝组织SOD和GSH的活性，病理学切片少见炎性细胞，其他无任何病变，肝脏指数接近正常水平，说明SAMe配伍APAP能拮抗对大鼠肝脏造成的损伤，高剂量SAMe拮抗作用明显。其原因可能是GSH在协调抗氧化防御过程中起着核心作用，APAP配伍SAMe使用，SAMe能阻止APAP引起的GSH耗竭，从而保护细胞免受APAP引起ROS释放的损伤[25-26]。

综上所述，较长时间服用APAP对肝脏有严重损害作用，与SAMe配伍则可以减轻这种损伤。为规避药物性肝损伤，可将APAP和SAMe制成一种复方制剂用于临床，既能减少较长时间内服用APAP造成的肝损伤，又能减少由于误服过量APAP可能诱导的肝损伤。