黄连素对人耐紫杉醇去势性前列腺癌细胞活力、增殖及HMGB1表达的影响*

张健， 彭煜晖， 李毅， 梁欣明， 付文莉， 张婷， 柏华, 禹文峰, 吴昌学* ， 张启芳*

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学第三附属医院 医学中心实验室， 贵州 都匀 558000)

前列腺癌是男性泌尿系统的恶性肿瘤，已成为全世界男性癌症相关死亡率的第2大原因[1]， 因其早期症状与前列腺炎相似，常被人忽视，致使多数前列腺癌患者在被诊断时已为转移性前列腺癌(metastatic prostate cancer， mPCa)[2]。mPCa通常接受雄激素剥夺治疗[3]，该疗法在早期阶段有效，然而许多mPCa患者慢慢发展雄激素不敏感，即去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)通常为CRPC 患者标准治疗选药，PTX是一种生物碱，可通过作用于细胞微管发挥其抗肿瘤作用，但是CRPC对PTX的耐药性限制了其治疗效果[4]。小檗碱(berberine，BBR)是一种天然生物碱化合物，存在于几种药用植物中，如刺檗；因它可从中药黄连中分离，又称黄连素，是黄连抗菌的有效成分[5]。近几年研究表明，BBR能通过不同靶基因有效地抑制几种肿瘤细胞生长，也可通过上调miR-203增强胃癌细胞对顺铂的敏感性，亦可通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路阻碍黑色素瘤细胞A375.S2迁移[6-7]；BBR可以诱导胶质母细胞瘤细胞U251和U87进入衰老状态，不再生长[8]；BBR通过诱导肝癌细胞自噬介导的死亡和凋亡介导的死亡[9]。但是，BBR对DU145R细胞的影响机制尚不清楚。此外，高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)在多种癌组织的表达也显著高于相应的正常组织[10-11]；HMGB1和RAGE共表达与前列腺癌不良预后密切相关[12]；小鼠结肠癌细胞CT26中，HMGB1的释放促进了细胞的转移[13]；HMGB1可通过激活蛋白激酶B信号通路从而促进前列腺癌的转移[14]。重要的是，在人耐PTX去势性前列腺癌细胞中抑制HMGB1的表达后，细胞增殖受到显著抑制[15]，但在人耐PTX去势性前列腺癌细胞中BBR是否与HMGB1作用尚不清楚。因此，本研究拟探讨BBR是否可通过HMGB1表达影响DU145R的细胞活力和增殖，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 人前列腺癌细胞株DU145细胞购于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，人耐PTX去势性前列腺癌细胞株DU145R为本实验室构建。

1.1.2主要试剂和仪器 RPMI 1640培养基及澳洲胎牛血清(美国Gibco)，黄连素(中国 大连美仑生物), 兔抗单克隆抗体HMGB1与HRP标记的抗兔的二抗(美国CST)，超敏化学发光试剂盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Millipore)，二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒和蛋白Marker(美国Thermo)，抗体稀释液、封闭液、十二烷基苯硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)凝胶配置试剂盒(中国碧云天)，PTX和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美国Sigma)，GeneGnome XRO NPC 化学发光成像仪(英国SYNGENE)，Varioskan LUX多通道酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rda MiniⅡ/Ⅲ垂直电泳仪和Bio-Rda powerpacHC高流电源(美国Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及处理 人前列腺癌细胞株DU145及PTX耐药前列腺癌细胞株DU145R放于含有10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培养基，5%CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2.2细胞活力检测 取对数生长期DU145R细胞，调整细胞悬液浓度为1×104个/孔，接种于96孔板中。使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR(即0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR组)处理48和72 h，使用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK8)检测450 nm波长处的光密度(optical density，OD)值，并计算抑制率[抑制率=(OD对照组-OD处理组)/OD对照组×100%]评估细胞活力。

1.2.3细胞克隆形成实验 取对数生长期DU145R细胞，消化重悬制备为单细胞悬液，调整细胞浓度为3×103接种于6孔板中，DMSO、10及 20 μmol/L BBR处理细胞(即DMSO组、10 μmol/L BBR组及20 μmol/L BBR组)，每3天更换1次含药物的培养基，14 d后甲醇固定，结晶紫染色并计算克隆形成数量。

1.2.4HMGB1基因表达分析及预后分析 利用Oncomine数据库分析HMGB1mRNA在人前列腺癌及正常组织中的差异表达，然后利用人蛋白质图谱(human protein atlas , HPA)数据库分析HMGB1在正常组织和前列腺癌中的蛋白表达差异；使用TIMER2.0在线分析工具分析HMGB1基因表达于前列腺癌患者预后的关系，根据HMGB1基因表达中位值将前列腺癌患者分为HMGB1高表达组与HMGB1低表达组。

1.2.5蛋白印迹(Western blot)法检测HMGB1蛋白表达 取对数生长期细胞DU145作为DU145组，0、10及20 μmol/L BBR处理对数生长期DU145R细胞分别作为0、10及20 μmol/L DU145R组，收集各组细胞，提取总蛋白，蛋白上样30 μg，80 V恒压电泳并将目的蛋白转移到PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，室温下孵育HMGB1一抗(1 ∶1 000)2 h，然后孵育抗兔二抗(1 ∶1 000)1 h，ECL超敏化学发光液检测蛋白的表达，利用Image J分析图像强度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞活力

使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR处理DU145R48和72 h后，CCK8试剂盒检测BBR对细胞活力的影响。结果表明，与0 μmol/L BBR组相比，各浓度组中DU145R细胞的抑制率降低(P<0.05或P<0.01)。见图1。

注： 0 μmol/L BBR组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 细胞增殖

克隆形成实验结果表明，与DMSO组相比，5 与10 μmol/L BBR组DU145R细胞的克隆形成数量减少(P<0.05或P<0.01)。见图2。

注： 与DMSO组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.3 HMGB1在耐药细胞高表达和与前列腺癌的临床相关性

采用Western blot法检测了HMGB1在DU145R中的表达，结果显示HMGB1在DU145R中的表达明显高于DU145细胞(P<0.001)；使用Oncomine数据库及HPA分别分析HMGB1在前列腺正常组织与前列腺癌中的mRNA及蛋白表达水平，结果显示，前列腺癌中的HMGB1 mRNA及蛋白表达水平均高于前列腺正常组织；利用TIMER2.0数据库获取前列腺癌患者生存数据，生存分析结果表明，HMGB1高表达与前列腺癌患者不良预后相关(P=0.019 3)。见图3。

注：A、B分别为HMGB1在DU145R中的表达和定量结果，C为HMGB1 mRNA 的表达，D、E分别为正常组织和前列腺癌组织中HMGB1蛋白表达(200×)，F为HMGB1表达与患者生存时间分析； (1)与DU145细胞或正常组比较，P<0.001。

2.4 HMGB1的表达

为了检测在DU145R细胞中BBR是否影响了HMGB1的表达，利用10和20 μmol/L BBR处理细胞12 h后，Western blot法检测HMGB1表达水平，结果显示，10和20 μmol/L BBR组DU145R细胞中HMGB1的表达水平分别低于0 μmol/L BBR组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示BBR能抑制DU145R细胞中HMGB1的表达。见图4。

注：(1)与0 μmol/L BBR组比较，P<0.05。

3 讨论

克服CRPC耐药性是临床治疗CRPC的一大难题[16]。本课题组前期结果表明PTX诱导的HMGB1的表达促进CRPC细胞的PTX耐药[15]。本研究结果显示，与对照组相比，BBR处理DU145R细胞后，细胞活力及增殖能力分别随着浓度的增加而降低 (P<0.05)，说明BBR能够抑制DU145R细胞活力及细胞增殖；在前列腺癌组织中HMGB1 mRNA水平和蛋白水平明显高于正常组织(P<0.001)，HMGB1高表达与前列腺癌患者不良预后相关(P=0.019 3)，这说明HMGB1与前列腺癌具有临床相关性；在蛋白水平上，BBR处理下调了HMGB1的表达，进一步揭示了BBR抑制DU145R细胞活力和增殖的机制。

肿瘤细胞以多种方式对化疗作出反应，包括诱导和释放损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns， DAMP)[17]。 DAMP可诱导免疫原性细胞死亡，从而促进宿主抗癌免疫力[12]。HMGB1是DAMP家族成员之一[18]。最近研究报道，由于前列腺素E2 (prostaglandin，PGE2)的作用，致使HMGB1并没有激活免疫活力的能力[17,19]。研究报道，HMGB1的敲低会增加细胞死亡，并在体内和体外恢复癌细胞的化学敏感性[20]，这表明此敲低可能导致诱导癌症进展和耐药性。释放到细胞外HMGB1可增强化疗后幸存的残余癌细胞的再生、转移和化学耐药性，例如释放的HMGB1能够促进骨髓瘤、乳腺癌、 肺腺癌、 前列腺癌、甲状腺癌及鼻咽癌等细胞的耐药性[21-26]。从本研究的结果可看出，BBR抑制了HMGB1的表达，提示BBR抑制DU145R细胞活力和增殖与HMGB1相关。此外，HMGB1在前列腺癌组织中表达明显增加，HMGB1高表达与前列腺患者不良预后相关。HMGB1作为检测对前列腺癌诊断指标之一[27-28]，说明HMGB1与前列腺癌具有临床相关性。综上所述，HMGB1是耐药前列腺癌细胞细胞的理想靶标。

有研究发现，BBR能够抑制顺铂耐药的胃癌细胞BGC-823及SGC-7901的活力[29]，抑制阿霉素耐药的乳腺癌细胞MCF-7活力及增殖[30]。与本研究结果相似，BBR能够有效地抑制DU145R细胞的活力及增殖。本课题组前期研究结果表明HMGB1表达促进CRPC细胞PTX耐药[11]。本研究结果显示BBR可明显抑制HMGB1在DU145R细胞的表达。

综上所述，BBR可以通过下调HMGB1表达抑制DU145R细胞活力和增殖，从而发挥抗肿瘤增殖活性，说明BBR有望成为克服PTX耐药的候选化药物。本研究未在动物体内进行体内实验验证，未来的工作中将在PTX抗性的CRPC小鼠模型中验证BBR是否可抑制PTX耐药。虽然本研究存在一定的局限性，但发现BBR能靶向HMGB1，从而为临床上研究新药物提供了新靶点。