表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠耐缺氧及抗疲劳作用的实验研究#

宋梦强 陈燕 杨正蓉 李成良 卢镇江 陈熙 肖贤培 郑倩

（1. 川北医学院2017级临床专业，四川 南充 637100；2. 川北医学院基础医学院机能中心，四川 南充 637100）

缺氧是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常的病理过程，长时间的供氧不足及用氧障碍会给机体带来严重危害，而大脑、心脏等生命重要器官缺氧也是导致机体死亡的重要原因[1]。疲劳是指机体在一定条件下，长时间繁重、紧张的脑力和体力劳动引起的工作效率暂时性降低的一种生理病理状态，疲劳可以导致缺氧产生。

疲劳状态不及时改善，可能会导致机体内分泌失调、免疫力下降、引起疾病的发生[2]。随着环境污染的进一步恶化以及生活节奏加快，使处于缺氧和疲劳状态的人群比例日益增加[3]。目前缺氧和疲劳产生的机制认为与自由基生成过多有关，体内自由基生成、脂质过氧化加速，造成自由基堆积，产生更多的氧化活性产物，造成机体的损害[4]。因此增加抗氧化能力，可以提高机体的缺氧耐受能力和抗疲劳作用，筛选提高机体的缺氧耐受能力和抗疲劳药物具有十分重要的现实意义。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶叶中含量最为丰富的一种儿茶素,约占总儿茶素50%～60%[5,6]。

目前研究认为EGCG作用广泛，具有抗肿瘤[7-9]，抗菌消炎[10]，降血脂，降血糖，预防心脑血管疾病以及神经元保护作用[11-14],多项报道认为EGCG可显著增加机体的抗氧化能力，抑制体内过氧化物生成，具有较强自由基清除能力[15-17]。但是EGCG对缺氧耐受和抗疲劳的研究较少，本实验通过两种不同浓度EGCG灌胃小鼠，观察其对低张性缺氧和亚硝酸钠中毒缺氧以及急性缺血缺氧三种模型的小鼠存活时间的影响，通过小鼠游泳和爬杆实验结果来评估EGCG抗疲劳作用，并通过测定小鼠肝脏中超氧化歧化酶（Superoxiadeismutase，SOD）的活性和丙二醛（Maleicdicdialdehyde，MDA）的含量来初步探究EGCG对缺氧耐受和抗疲劳的机制，为EGCG开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年雄性健康昆明小鼠75只，体重24-28 g，小鼠由川北医学院动物实验中心提供（许可证号为SCXK(川）2018-18）。小鼠饲养温度为26 ℃，普通饲料由川北医学院动物实验中心提供。

小鼠随机分为3组：对照组（NOR)、低剂量组EGCG1（10 g·（kg·d）-1）、高剂量组EGCG2（50 g·（kg·d）-1），EGCG组每天中午14时连续给小鼠灌胃 25 d；对照组灌胃生理盐水，每天中午14时灌胃0.1 g·kg-1生理盐水，持续25 d。每组中再随机分为五组：低张性缺氧、亚硝酸钠中毒性缺氧实验、急性缺血缺氧实验和小鼠负重游泳实验和爬杆实验，其中进行爬杆实验的小鼠需要进行爬杆训练，每天1次，每次5 min。

1.2 实验仪器及试剂

实验仪器：缺氧瓶、灌胃针、离心管、微孔板、组织研磨器、离心机、恒温水浴箱等。

试剂：EGCG（北京索莱宝科技有限公司，Cat#SE8120）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所，A001-1 ），丙二醇（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，A003-1），BSA标准品、BCA工作液。

1.3 实验方法

1.3.1 低张性缺氧实验

EGCG灌胃25 d，各组小鼠最后一次灌胃30 min后，每组随机选出5只小鼠放入缺氧瓶中，瓶中盛有5 g钠石灰，每个缺氧瓶放1只小鼠，为确保缺氧瓶的密闭性，小鼠放入后用凡士林涂抹瓶口周围，并立即计时，准确记录小鼠死亡时间。判断标准为小鼠胸口不再起伏，死亡时间为判定小鼠对低张性缺氧耐受时间。

1.3.2 亚硝酸钠中毒性缺氧实验

EGCG灌胃25 d，各组小鼠最后一次灌胃30 min后，每组随机选出5只小鼠，小鼠采用腹腔注射5%亚硝酸钠溶液（0.1 L·kg-1）,给药后立即记录小鼠死亡时间，判断标准和低张性缺氧实验一致。

1.3.3 急性缺血缺氧实验

EGCG灌胃25 d，各组小鼠最后一次灌胃 30 min后，每组随机选出5只小鼠，用剪刀自小鼠颈部快速断头，观察断头后小鼠张口喘息，秒表记录其出现张口喘息至停止呼吸的时间，时间为判定小鼠急性缺血缺氧实验耐受时间。

1.3.4 小鼠负重游泳实验

EGCG灌胃25 d，各组小鼠最后一次灌胃30min后，每组随机选出5只小鼠，将小鼠放入水槽水温稳定于25±2℃环境中进行游泳实验，小鼠1/3—2/3处绑缚自身体重8%铅丝，且系铅丝的绳子不能接触水槽底，在整个实验过程每只小鼠四肢需要不停运动，用秒表准确记录小鼠负重游泳时间，判断标准为小鼠入水至头部全部入水持续 8S内不能浮出水面为止的时间。

1.3.5 小鼠爬杆实验

EGCG灌胃25 d，各组小鼠最后一次灌胃 30 min后，每组随机挑选5只，小鼠分别放在长110 cm、 直径7 mm的垂直悬挂的光滑玻璃棒上端，记录小鼠从爬杆开始，直至肌肉疲劳而无力抱住玻璃棒滑落地上的时间。

1.3.6 肝脏SOD活性和MDA含量测定

小鼠低张性缺氧死亡后迅速解剖取出肝脏，放入盛有9倍体积的0.9%氯化钠溶液，将剪碎的肝脏组织充分研磨，制备好的匀浆离心10 min（3000 rpm·min-1），上清液分装待用。根据SOD、MDA试剂盒说明书操作，通过计算即可求出被测样品中MDA含量及SOD活力。

1.4 统计学分析

数据相关资料采用SPSS18.0软件来进行分析，计量资料均采用均数±标准差（±SD）表示，组间采用方差和t检验，P＜0.05表示结果有显著差异。

2 结果

2.1 不同浓度EGCG对小鼠缺氧模型的影响

对小鼠低张性缺氧的影响，给予小鼠灌胃EGCG 25天后，检测各组之间小数低张性缺氧差异，与干预前相比，EGCG组的小鼠低张性缺氧死亡时间均明显延长，其中高剂量组作用更为明显（P＜0.05）。对小鼠亚硝酸钠中毒性缺氧实验发现EGCG组明显延长存活时间，高剂量组延长更为显著（均P＜0.05），显示不同浓度EGCG灌胃后明显延长小鼠亚硝酸中毒缺氧耐受的时间。与对照组相比，高、低剂量EGCG组小鼠断头后张口呼吸时间明显延长（P＜0.05），结果表明，EGCG在一定程度上能提高小鼠急性缺血缺氧的存活时间。结果参见表1和图1。

表1 EGCG对小鼠低张性缺氧、亚硝酸钠和急性缺血缺氧的影响（±SD）

表1 EGCG对小鼠低张性缺氧、亚硝酸钠和急性缺血缺氧的影响（±SD）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 n 低张性缺氧存活时间（min） 亚硝酸钠中毒性缺氧存活时间（min） 急性缺血缺氧实验（min) NOR 5 6.34±0.21 20.73±1.64 19.30±0.62 EGCG1 5 8.97±0.43* 26.76± 1.48 * 22.56+2.63* EGCG2 5 9.39±0.61* 29.41± 2.06* 25.49+3.25*

图1 不同浓度EGCG对小鼠低张性缺氧、亚硝酸钠中毒性缺氧和急性缺血缺氧的影响

2.2 不同浓度EGCG对小鼠负重游泳的影响

低浓度负重游泳时间从对照组96.4±13.50s提高到303.56±20.01s，与干预前相比，高浓度负重游泳时间从96.4±13.50s增加到451.75±124.1s，结果表明高、低浓度EGCG两组小鼠负重游泳时间明显提高，具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 EGCG对小鼠爬杆实验和负重游泳实验的影响（±SD）

表2 EGCG对小鼠爬杆实验和负重游泳实验的影响（±SD）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 n 爬杆时间（s） 游泳时间（s） NOR 5 74±8.48 96.4±13.50 EGCG1 5 83.5±16.42＃ 303.56±20.01*EGCG2 5 415.25±124.13* 451.75±63.25 *

2.3 不同浓度EGCG对小鼠爬杆实验的影响

给予小鼠灌胃EGCG 25d后进行爬杆实验，与对照组比较，EGCG1低剂量组延长爬杆时间，但是差异无统计学意义。EGCG2高剂量组爬杆时间明显延长，提示小鼠抗疲劳能力明显上升，且差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 各组小鼠肝组织匀浆中MDA含量和SOD活性

如表3所示，与NOR组相比，高、低剂量EGCG组小鼠肝脏匀浆MDA含量明显减少（P＜0.05），说明EGCG可以降低肝脏中MDA的含量，且EGCG可显著提高SOD的活性，与对照组有统计学差异（P＜0.05）。

表3 EGCG对小鼠肝脏SOD活性、MDA含量的影响（±SD）

表3 EGCG对小鼠肝脏SOD活性、MDA含量的影响（±SD）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 n SOD活性(μ·g-1) MDA(nmol·g-1) NOR 5 156.21±10.06 5.92±1.26 EGCG1 5 184.91±28.19* 4.25±0.08* EGCG2 5 197.04±26.63* 4.18±0.07*

3 讨论

低张性缺氧、亚硝酸钠中毒缺氧实验、急性脑缺氧实验是常用的缺氧模型。小鼠的存活时间是判定小鼠抗缺氧和抗疲劳的重要指标，三项实验任意两项实验结果阳性，可判定该受试样品有助于提高缺氧耐受力[18]。本实验发现EGCG可提高小鼠在低张性缺氧瓶中存活时间，可见EGCG具有显著的抗低张性缺氧的作用。亚硝酸钠具有氧化作用，使机体的血红蛋白变成高铁血红蛋白，从而血红蛋白丧失携带氧气的能力，导致机体缺氧[19]。本试验EGCGG灌胃后腹腔注射亚硝酸钠，结果显示EGCG可以明显提高小鼠在亚硝酸钠条件下的存活时间，说明其能减弱亚硝酸盐的氧化作用，提高血红蛋白携带氧气的能力，从而改善缺氧状况。实验同时观察到EGCG亦可以提高小鼠急性断头下的喘息时间，增加存活时间，具有统计学意义，提示EGCG对急性缺氧有保护作用。低张性缺氧、亚硝酸钠中毒缺氧实验、急性脑缺氧实验均说明EGCG能提高小鼠缺氧耐受力，可能与改善大脑和心脏缺氧状态有关。

负重游泳和爬杆实验是反映耐疲劳的常用方法。实验结果显示，EGCG可以显著延长小鼠负重游泳时间和爬杆时间（P＜0.05），说明EGCG可以提高小鼠抗疲劳能力，缓解运动疲劳。SOD是机体清除氧自由基的重要酶，是反映机体抗氧化水平的重要指标[20]。MDA是自由基引起的脂质过氧化的主要产物，其含量可以间接反映机体抗氧化能力及清除氧化产物的能力[21]，因此SOD和MDA可以作为反应抗氧化能力的指标。本实验通过测定小鼠肝脏SOD的活性和MDA的含量来探究EGCG对缺氧耐受和抗疲劳机制与抗氧化能力的关系。

结果显示高、低剂量EGCG组与对照组相比，SOD的活性有明显的增加趋势，而MDA的含量降低。证明EGCG可通过上调抗氧化酶SOD的活性，减少体内MDA的生成，减少氧化损伤，从而产生缺氧耐受和抗疲劳作用。

本实验证实EGCG为在耐缺氧及抗疲劳方面的开发和应用提供了实验依据，说明其具有开发为抗缺氧和抗疲劳产品的潜力，但是机制需要进一步研究。