多脂鳞伞的化学诱变育种

解生权+全艳玲

摘要：以紫外线诱变后得到的多脂鳞伞（Pholiotasdiposa）的菌种作为出发菌种，对其进行化学诱变剂处理。结果表明，采用亚硝酸钠终浓度3450mg/L诱变10min、亚硝酸钠终浓度6900mg/L诱变5min所得到的变异菌株菌丝生长速度、菌丝产量和栽培的生物转化率都有所提高。

关键词：多脂鳞伞；化学诱变；育种；亚硝酸钠；生长速度；产量；生物转化率

中图分类号：S646.036 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0244-02

各种研究表明，多脂鳞伞（Pholiotasdiposa）作为食用真菌具有极其丰富的营养价值，含有大量的人体必需氨基酸、矿物质、维生素等，是理想的营养食品之一；此外，其体内还有多糖、麦角固醇、核酸等生物活性物质，对提高机体免疫力、抑菌、抗癌、延缓肌肉疲劳、恢复精力和脑力十分有效。各地栽培经验证明，多脂鳞伞具有适应性强、原料易得、质优高产、商品性状好、抗污染能力强等优点，是一种具有开发价值、市场前景好的食用菌，其推广栽培已经引起人们的重视；但是，各地栽培所使用的菌种大都是野生驯化而来的，产量都不尽如人意。本研究将栽培使用的菌种经过紫外线诱变得到1株高产的菌株（UV-65），并在此基础上对其菌丝体进行化学诱变，以期得到产量更高的菌株。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源经过紫外线诱变得到的菌株UV-65。

1.1.2培养基及制备（1）液体培养基。马铃薯（去皮）100g、胡萝卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、蛋白胨10g，水1000mL。马铃薯与胡萝卜分别煮汁、过滤后合并，再加入其他成分，补足水分后充分溶解再分装到500mL锥形瓶中，每瓶200mL，121℃灭菌30min，备用。（2）固体培养基。马铃薯（去皮）100g、胡萝卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、蛋白胨10g、琼脂20g，水1000mL。按上述方法溶解灭菌，做成斜面、平板备用。（3）栽培培养基。阔叶木屑78%、玉米粉20%、蔗糖1%、石膏1%，水60%，pH值自然。常规拌料、装袋、126℃灭菌2h。

1.2方法

1.2.1活化菌种将液体石蜡保藏的UV-65出发菌种接种到斜面培养基上，（26±2）℃下避光培养。待菌丝长满试管后，再传代1次，长满后作为母种使用。

1.2.2液体菌种的制备用无菌接种铲取一小块活化的母种（0.5cm×0.5cm），尽量去除培养基，接种到液体培养基中，并使其漂浮在液面上。然后置于（26±2）℃、160r/min左右的全温振荡培养箱内培养，待瓶中菌丝球生长到2～3mm、发酵液澄清透明且无污染时停止培养，置于4℃下保藏备用。

1.2.3诱变处理利用不同浓度的亚硝酸钠对液体培养出的菌丝球进行不同时间的诱变处理，即取5mL上述菌悬液加入100mL无菌的锥形瓶中，并用无菌水稀释至10mL，再加入无菌亚硝酸钠溶液，使之最终浓度为0、3.45、6.9、10.35、13.8、17.25g/L，每个浓度3个平行样本，以终浓度O为空白对照。对以上各个等级的样本在（26±2）℃、160r/min的条件下分别振荡5、10、15、20、25、30min，再加入pH值为8.6的Na2HP04溶液，调整pH值为7，终止诱变作用。

1.2.4菌种筛选将上述进行不同诱变处理时间的各个浓度等级中的悬液混匀，无菌取等量的悬液接种到平板培养基上，（26±2）qC下避光培养，计数不同诱变处理时间、不同浓度的菌落数量，并计算致死率。对致死率达到75%-90%的组别中的培养菌落进行生长速度的测定。

2.结果与分析

2.1不同方式诱变处理后的菌落培养情况

用不同浓度的亚硝酸钠对上述液体培养物进行不同时间的诱变，培养出的菌落情况见图1。

2.2目的菌株的筛选

从图1可以看出，当在亚硝酸钠终浓度为3.45g/L下诱变10nlln、在亚硝酸钠终浓度为6.90g/L下诱变5min时，致死率在75%～90%之间。对其进行编号（UVN6500510-1、UVN6500510-2、UVN6500510-3、UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN6500510-6；UVN65015-1、UVN65015-2、UVN65015-3、UVN65015-4）并测定其生长速度和生长量。

2.2.1

固体培养时菌丝生长速度的测定将上述所有筛选出的菌株分别转接到平板培养基上，按前述的方式进行培养后，用无菌打孔器（直径0.5cm）切取种块（尽量去除培养基）接种到12cm平板培养基上，每隔48h测量菌落直径（表1）。

2.2.2液体培养时菌丝生长量的测定取所有筛选出的菌株接入液体培养基，在（26±2）℃、160r/min下振荡培养，每隔24h混匀并定量取样，相同离心力下离心相同时间并烘干至恒质量，再称其质量，结果见表2。

从表1、表2可以看出，菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3的生长速度和菌丝产量都比出发菌株提高了10%以上；而其他菌株虽然也有所提高，但是幅度较小，有些不具有统计学意义。

2.2.3栽培生物转化率的比较取上述3种变异菌株的斜面种接种到栽培培养基中，并以出发种作为对照，霉菌培养箱[温度（26±2）℃、湿度65%]中避光培养，观察菌丝生长速度时发现，长满栽培培养基的时间分别为24.67、25.15、24.86、29.13d。由此可见，变异菌株栽培时菌丝生长速度也有所加快。菌丝长满后，进行必要的温差、湿差的刺激出菇，连续采摘3次，计算生物转化率（表3）。

2.2.4变异菌株的遗传稳定性将菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3做成斜面种保存在液体石蜡中，在此期间连续5次传代，并测定每代菌丝生长速度、发酵产量。结果发现，经过长期保存并多次传代菌丝生长速度、发酵产量、生物转化率3项指标未发生统计学意义上的变化，说明这3株菌株遗传性状是比较稳定的，可以应用于规模栽培。

3.结论

微生物育种运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，以提高产品的产量和质量。微生物菌种选育技术在现代生物技术中，特别是发酵产业中具有十分重要的地位。通过对微生物菌种的选育可以有效提高产品的产量和质量。微生物育种技术主要有自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种等5种方式，各种方式并不孤立存在，而是相互交叉、相互联系的。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展，而现在最常用的育种方式是诱变育种，即利用物理、化学诱变剂对微生物进行处理，从而筛选出主要生物性状优良的变异菌株。本研究对紫外线诱变得到的变异菌株利用典型的化学致变剂进行进一步的化学诱变，实际上进行复合诱变，筛选出3株菌抹，其生长速度、发酵产量、生物转化率等主要生物学指标较原始菌株都有较大的提高，这对大规模种植增产奠定了坚实的基础。变异菌株进行发酵、栽培所得产物的成分变化有待进一步研究。endprint