丁苯酞联合肢体缺血后处理对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用#

阳昀 程超 张冲 唐园燕 廖小明 周茜

（桂林医学院第二附属医院神经内科，广西 桂林 541199）

2009年，Ren等人首次证实肢体缺血后处理（Limb ischemic postconditioning，LPostC）可减轻脑缺血再灌注损伤[1]。自此，随着研究的深入这一结论被众多国内外学者证实[2]，且由于其安全、操作简单易于推广，因此具有广阔的临床前景。本课题前期研究发现LPostC通过抵抗氧化应激、减轻血脑屏障损伤和抑制凋亡来发挥保护作用[3-5]。在多种动物模型及临床研究中，丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）均被证实具有改善脑缺血再灌注损伤效果[6-8]，现已作为我国急性缺血性脑卒中诊治指南推荐用药。但目前未见NBP联合LPostC治疗缺血性脑卒中的相关报道。本实验拟探讨NBP联合LPostC对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，以期为临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

丁苯酞胶囊（石药集团恩必普药业有限公司），DAB显示试剂盒、Caspase-3兔多克隆抗体和Caspase-9兔多克隆抗体（碧云天生物技术公司）、SOD、MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），DD-2型双极电凝器（北京东方神健医疗器械有限公司），752型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.1.2 动物与分组

SPF级雄性SD大鼠75只，体重250～280 g（由桂林医学院动物实验中心提供）。随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、肢体缺血后处理组（LPostC组）、丁苯酞（Dl-3-n-Butylphthalide，NBP）后处理组（NBP组）和同时予NBP+LPostC的联合后处理组（NL组），每组15只。

1.1.3 大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备及治疗

除假手术组外，所有大鼠均采用石蜡线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型，具体如下：SD大鼠经腹腔注射10%水合氯醛300 mg·kg-1麻醉后，游离左侧颈外动脉，用头端蘸有石蜡的鱼线（φ= 0.26 mm）从左侧颈外动脉插入，深度约18～20 mm，栓塞左侧大脑中动脉。缺血2 h后，将线栓拔出1 cm实现再灌注。

缺血2 h后，NBP组和NL组腹腔注射丁苯酞80 mg·kg-1，其余大鼠腹腔注射等体积生理盐水。LPostC组与NL组在再灌注同时，夹闭双侧股动脉5 min，再灌注5 min，反复循环3次后，再灌注24 h。

1.2 方法

1.2.1 神经功能评定

神经功能缺损评分：参照Longa等评分标准，各组随机选取10只大鼠，分别于再灌注24 h后进行评分。0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全伸展右前肢；2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺损评分在1～3分为模型成功，0分和4分为模型不成功。

1.2.2 比色法测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）含量

再灌注24 h后，每组随机选5只大鼠断头取脑，取梗死侧大脑半球制成10%脑组织匀浆，以3000 r·min-1离心10 min、取上清液，BCA法测定蛋白浓度，按试剂盒说明书进行MDA和SOD测定。

1.2.3 免疫组化测定Caspase-3和Caspase-9表达

再灌注24 h后，各组随机选取5只大鼠断头取脑，切取视交叉前后各2 mm厚的脑组织块，经常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后切成厚5 μm薄片，采用免疫组化法检测Caspase-3和Caspase-9的表达，胞核出现棕黄染色颗粒为阳性细胞。在10×40倍光学显微镜下，随机计数3个视野阳性细胞数，算出平均值，即为每张切片阳性细胞数目。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 18.0对数据进行分析，所有数据均采用均数±标准差（±SD）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（One way ANOVA）进行组间比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评定

Sham组大鼠术后24 h精神可，一般行为状态正常，无神经功能缺损症状及体征, 评分0分。与Sham组相比，I/R组、NBP组、LPostC组和NL组均出现不同程度的偏瘫，评分明显升高（P＜0.05）。相较I/R组，NBP组、LPostC组及NL组神经功能评分降低（P＜0.05）；且NL组评分比NBP组和LPostC组更低。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（±SD, n=10）

表1 各组大鼠神经功能评分比较（±SD, n=10）

注：与Sham组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，#P＜0.05；与NBP组比较，◆P＜0.05；与LPostC组比较，∆P＜0.05。

组别 神经功能评分 Sham组 0 I/R组 2.6±0.16* NBP组 1.7±0.15# LPostC组 1.8±0.0.2# NL组 1.2±0.13♦Δ

2.2 脑组织匀浆中MDA含量和SOD活性的变化

与Sham组相比，I/R组脑组织中MDA含量明显增加，SOD活性明显降低（P＜0.05）；与I/R组比较，NBP组、LPostC组和NL组脑组织中MDA含量明显减少，SOD活性显著升高（P＜0.05）；与NBP组和LPostC组相比，NL组脑组织中MDA含量进一步减少，SOD活性进一步升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠脑组织中MDA含量、SOD活性的比较（±SD, n=5）

表2 各组大鼠脑组织中MDA含量、SOD活性的比较（±SD, n=5）

注：与Sham组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，#P＜0.05；与NBP组比较，♦P＜0.05；与LPostC组比较，ΔP＜0.05。

组别 MDA（nmol·mgprot-1） SOD（U·mgprot-1） Sham组 3.23±0.11 160.6±4.06 I/R组 6.21±0.22* 64.0±3.26* NBP组 3.96±0.12# 107.4±4.31# LPostC组 3.89±0.11# 107.8±4.77# NL组 4.63±0.19♦Δ 121.8±2.89♦Δ

2.3 各组大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9阳性细胞数

Sham组大鼠脑组织仅有少量阳性细胞表达；而与Sham组相比，I/R组阳性细胞表达数明显增加（P＜0.05）。与I/R组相比，NBP组、LPostC组和NL组阳性细胞显著减少（P＜0.05）；与NBP组和LPostC组相比，NL组抑制Caspase-3和Caspase-9表达程度更强（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9阳性细胞情况（±SD，n=5）

表3 各组大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9阳性细胞情况（±SD，n=5）

组别 Caspase-3阳性细胞 （个·HP-1） Caspase-9阳性细胞 （个·HP-1） sham组 6.2±1.16 5.8±1.15 I/R组 47.4±2.46* 49.2±2.22* NBP组 20.0±1.58# 23.8±1.53# LPostC组 23.2±1.66# 24.4±1.65# NL组 14.6±1.44♦Δ 15.8±1.36♦Δ

3 讨论

我国约70%卒中患者为缺血性脑卒中[9]，恢复缺血区域血流灌注是治疗策略的重点；然而目前对于缺血再灌注损伤的发生仍是治疗的难点，普遍认为其相关病理生理机制主要包括氧化应激（氧自由基大量产生）、炎性因子升高、细胞凋亡、血脑屏障破坏等[10-12]。本项研究表明，脑缺血再灌注损伤后，以MDA为代表的脂质过氧化产物大量生成，引发氧化应激反应；同时凋亡因子Caspase-3和Caspase-9活性显著增强，诱导细胞凋亡发生；这与前人的研究结果一致。

多年来，众多学者致力于探索减轻脑缺血再灌注损伤的药物与措施。丁苯酞是我国自主研发的药物，研究表明其神经保护作用与改善大脑缺血区血流量及微循环、抗血小板聚集与血栓形成、抑制细胞凋亡、抗自由基作用等有关[13-15]。LPostC也被证实对脑缺血再灌注损伤具有保护机制，其主要机制包括调节突触信号、减轻氧化应激和炎症、维持线粒体完整性、抑制内质网应激、调节自噬、激活PI3K/Akt通路、抑制细胞凋亡、保护神经血管单位等[16]。

目前未见关于LPostC联合丁苯酞治疗缺血性脑卒中的相关研究，联合应用是否可增强神经保护作用也未见报道。本研究结果表明，丁苯酞和LPostC均可减少MDA含量及增加SOD活性，提示机体减少产生脂质过氧化物且清除氧自由基能力增强，表明氧化应激被抑制；这与前人的研究结果一致。此外，我们还发现LPostC联合丁苯酞可提高减少MDA产生及SOD活性，强化氧自由基的清除能力，更好的抵抗氧化应激反应。

天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白激酶家族（Caspases）是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶。脑缺血后线粒体受损导致线粒体膜持续开放，细胞色素C、dATP、凋亡蛋白激活因子-1等形成复合体，激活Caspase-9及下游的Caspase-3，促使细胞凋亡发生[17]。本研究显示，丁苯酞和LPostC均下调Caspase-3和Caspase-9表达，并且联合应用可进一步抑制其表达，从而减少细胞凋亡，从而挽救更多的缺血半暗带组织，减轻缺血再灌注损伤。

综上所述，肢体缺血后处理或丁苯酞后处理均对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，且联合应用的神经保护效果更好，其机制可能其与抑制氧化应激反应、减少细胞凋亡有关。

PROGRESS

Preliminary Findings of mRNA Covid-19 Vaccine Safety in Pregnant Persons

Tom T Shimabukuro, et al.

Preliminary findings did not show obvious safety signals among pregnant persons who received mRNA Covid-19 vaccines. However, more longitudinal follow-up, including follow-up of large numbers of women vaccinated earlier in pregnancy, is necessary to inform maternal, pregnancy, and infant outcomes.

N Engl J Med. 2021 Apr 21;NEJMoa2104983. doi: 10.1056/NEJMoa2104983.