新型二氢叶酸还原酶抑制剂iclaprim对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性

郝凌云， 何春燕， 杨 涵， 陈雯静， 崔泽林， 汤 荣， 舒 文， 刘庆中

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是临床上引起皮肤软组织感染、心内膜炎、骨髓炎和血流感染等疾病的常见病原菌。由于抗菌药物的广泛使用导致金葡菌耐药性不断增强，给全球公共卫生安全带来较大威胁[1]。

二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）是细菌叶酸合成和DNA复制过程的重要生物合成酶[2]。其新型选择性抑制剂iclaprim是基于甲氧苄啶的结构数据优化设计合成，与DHFR更具亲和力，具有更强的体内外抗金葡菌（包括MRSA）活性，并能抑制金葡菌毒素表达[3-4]。研究显示，iclaprim在血浆中具有快速杀菌作用[5]，该药针对金葡菌皮肤软组织感染及院内肺炎治疗目前已进入Ⅲ期临床试验[2]。

为了解iclaprim对本地区细菌的体外抗菌活性，本研究收集了上海交通大学附属第一人民医院临床分离的金葡菌498株，检测其对iclaprim的敏感性，并与甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑比较。同时，探讨iclaprim与磺胺类药物联合使用对金葡菌的体外协同作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2016年1月—2018年12月我院分离自各种临床标本的非重复金葡菌498株。所有菌株均经VITEK 2-Compact微生物鉴定系统鉴定。金葡菌ATCC 25923 （纸片法）和ATCC 29213（肉汤微量稀释法）为药敏试验质控菌株。

1.1.2 仪器和试剂 VITEK 2-Compact微生物鉴定系统及配套鉴定卡片为法国生物梅里埃公司产品；iclaprim粉剂为美国MedChemExpress（MCE）公司产品；甲氧苄啶和磺胺甲唑粉剂购于美国Sigma-Aldrich公司；头孢西丁纸片（30 μg /片）为英国OXOID公司产品；阳离子调节Mueller–Hinton（MH）肉汤购于美国BD公司；96孔无菌细胞培养板由美国Corning公司提供。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 参照CLSI 2019年推荐的肉汤微量稀释法[6]检测iclaprim、甲氧苄啶、磺胺甲唑、iclaprim-磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑对菌株的最低抑菌浓度（MIC）。各种药物检测浓度范围：iclaprim为0.015～16 mg/L，甲氧苄啶为0.015～64 mg/L，磺胺甲唑为16～1 024 mg/L，甲氧苄啶-磺胺甲唑（1∶19）为（0.015-0.285）～（16-304） mg/L，iclaprim-磺胺甲唑（仿照甲氧苄啶-磺胺甲唑配方，1∶19）为（0.015-0.285）～（8-152） mg/L。

1.2.2 结果判定 以甲氧苄啶MIC≤8 mg/L为敏感，≥16 mg/L为耐药；磺胺甲唑MIC≤256 mg/L为敏感，≥512 mg/L为耐药；甲氧苄啶-磺胺甲唑MIC≤2-38 mg/L为敏感，≥4-76 mg/L为耐药[6]。iclaprim目前并无发布的临床折点，根据MRSA的MIC值分布、药动学/药效学及Ⅱ期和Ⅲ期临床试验结果，文献[7]建议iclaprim对金葡菌的MIC≤1 mg/L为敏感。iclaprim-磺胺甲唑联合药敏试验用分级抑菌浓度指数（FIC） （FIC=评估。FIC≤0.5为协同作用，0.5＜FIC≤1为相加作用，1＜FIC≤2为无关作用，FIC＞2为拮抗作用[8]。

1.2.3 甲氧西林敏感性检测 根据文献[6]，头孢西丁纸片法检测金葡菌对甲氧西林的敏感性，抑菌圈直径≤21 mm为耐药（即MRSA），≥22 mm为敏感（即MSSA）。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对实验结果进行卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲氧西林耐药性

498株金葡菌中，268株（53.8%）对甲氧西林耐药，为MRSA；230株（46.2%）敏感，为MSSA。

2.2 iclaprim和iclaprim-磺胺甲唑的MIC分布

498株金葡菌中，iclaprim的MIC范围为0.015～＞16 mg/L， MIC50、MIC90为0.25、0.5 mg/L。根 据MIC50、MIC90值，MRSA（0.25、0.5 mg/L）和MSSA（0.12、0.25 mg/L）间仅有1个稀释梯度的差别，因此iclaprim对两者具有相似的抗菌能力。所有菌株中，有35株（7.0%）对iclaprim敏感性降低（MIC＞1 mg/L），且不敏感率在MRSA和MSSA菌株间差异无统计学意义（8.6%对5.2%，χ2=2.145，P=0.143）。iclaprim 对金葡菌的MIC值分布见表1。

表1 Iclaprim、甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表1 Iclaprim、甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性Table 1 In vitro activities of iclaprim, trimethoprim, sulfamethoxazole, and trimethoprim-sulfamethoxazole against S. aureus isolates

a Intermediate or resistant (nonsusceptible).MRSA, methicillin-resistant S. aureus; Trimethoprim-sulfamethoxazole combination =1:19; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria /Antimicrobial agent MIC range/(mg/L) MIC50 /(mg/L) MIC90/(mg/L) Ra/% S/%MRSA (n=268)Iclaprim 0.06-＞16 0.25 0.5 8.6 91.4 Trimethoprim 0.5-＞64 2 16 10.0 90.0 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 9.0 91.0 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.5 5.6 94.4 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015-＞16 0.12 0.25 5.2 94.8 Trimethoprim 1-＞64 2 4 8.7 91.3 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 2.2 97.8 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.12 5.2 94.8 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015-＞16 0.25 0.5 7.0 93.0 Trimethoprim 0.5-＞64 2 8 9.6 90.4 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 5.8 94.2 Trimethoprim-sulfamethoxazole ＜0.015/0.285-＞16/304 0.06 0.25 5.4 94.6

2.3 iclaprim对甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药菌株的抗菌活性

表1显示，有48株（9.6%）、29株（5.8%）和27株（5.4%）的金葡菌分别对甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药。金葡菌对iclaprim的不敏感率较低（7.0%），与上述三种药的耐药率差异无统计学意义（P值分别为0.136、0.438和0.294，P＞0.05）48株甲氧苄啶耐药菌的iclaprim MIC范围为0.12～＞16 mg/L，比全部金葡菌的范围窄4个稀释梯度，其中43.8%（21/48）对iclaprim不敏感；29株磺胺甲唑耐药菌的iclaprim MIC范围为0.06～＞16 mg/L，44.8%（13/29）对iclaprim不敏感；27株甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药菌的iclaprim MIC范围为2～＞16 mg/L（全不敏感），更是比甲氧苄啶耐药金葡菌又下降了4个稀释梯度。需要指出的是，无论甲氧苄啶、磺胺甲唑和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药与否，都有iclaprim MIC较高的菌株（≥16 mg/L）。对于三种药物耐药的MRSA，iclaprim的抗菌活性也显著低于其敏感的MRSA菌株（根据MIC90值相差≥32倍）。不过无论甲氧西林耐药与否，三种药物耐药的菌株都具有很高的iclaprim MIC90值（≥16 mg/L）。

3 讨论

DHFR参与细菌叶酸和胸苷合成，是抗菌药物开发的重要靶点[9-10]。甲氧苄啶作为FDA唯一批准的DHFR抑制剂使用已近40年[10]，出现了与其亲和力降低的DHFR突变型（如金葡菌DHFR的F98Y突变）[11-13]，导致抗菌活性下降[14]。由于抗菌活性相对较差，且易于产生耐药性，临床上甲氧苄啶常与增效剂磺胺甲唑联合使用（即甲氧苄啶-磺胺甲唑）[9]。不过，甲氧苄啶-磺胺甲唑能引起磺胺相关的严重不良反应，如过敏反应、恶液质、肝毒性等[15]。而iclaprim是一种单药成分，没有上述安全缺陷，效力比甲氧苄啶提高了近20倍[16]，与甲氧苄啶-磺胺甲唑具有相似的抗菌能力[2,16]。因此，iclaprim有可能成为金葡菌感染的替代治疗药物。

表2 Iclaprim联合磺胺甲唑对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

表2 Iclaprim联合磺胺甲唑对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性Table 2 In vitro antimicrobial activity of iclaprim in combination with sulfamethoxazole against S. aureus isolates

Iclaprim-sulfamethoxazole combination= 1:19. MRSA, methicillin-resistant S. aureus; MSSA, methicillin-sensitive S. aureus.

Bacteria/ Antimicrobial agent Fractional inhibitory concentration /n (%)≤ 0.5(Synergy） 0.5 to ≤ 1(Additive) 1 to ≤ 2(Indifference) ＞2(Antagonism)MRSA (n=268)Iclaprim 266 (99.3) 2 (0.7) 0 0 Sulfamethoxazole MSSA (n=230)Iclaprim 230 (100) 0 0 0 Sulfamethoxazole S. aureus (n=498)Iclaprim 496 (99.6) 2 (0.4) 0 0 Sulfamethoxazole Bacteria/ Antimicrobial agent Single antibiotic/(mg/L) Iclaprim-sulfamethoxazole combination/(mg/L)a MIC range MIC50 MIC90 MIC range MIC50 MIC90 Synergism MRSA (n=268)Iclaprim 0.06->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 8-16 Sulfamethoxazole 32-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449 MSSA (n=230)Iclaprim 0.015->16 0.12 0.25 0.015-8 0.015 0.03 8 Sulfamethoxazole 16-1024 128 128 0.285-152 0.285 0.57 224-449 S. aureus (n=498)Iclaprim 0.015->16 0.25 0.5 0.015-8 0.015 0.03 16 Sulfamethoxazole 16-1024 128 256 0.285-152 0.285 0.57 449

目前，国际上已有iclaprim体外抗菌活性的报道[7,17-21]，不过我国仍然缺乏相关数据。北美和欧洲的数据显示，iclaprim对金葡菌具有高度活性（MIC50、MIC90为0.03～0.06、0.12 mg/L），南 美和亚太地区的金葡菌也具有较低的MIC50、MIC90（0.06、0.12 mg/L）[7,17-18]。本结果显示，绝大多数临床金葡菌（93.0%）对iclaprim敏感，但MIC50、MIC90值（0.25、0.5 mg/L）要高于上述国外报道，表明iclaprim对本研究菌株的活性弱于国外菌株4～8倍。出现这种情况可能与我国流行的菌株克隆与国际上其他地区不同有关。另外，本研究还显示iclaprim对金葡菌的活性基本不受甲氧西林的耐药性影响，MRSA和MSSA菌株的MIC50、MIC90值仅相差1个稀释梯度。

iclaprim对F98Y DHFR能维持足够的亲和力[4]。但是，本研究并未观察到iclaprim与甲氧苄啶在耐药率上存在显著差异，而且43.7%甲氧苄啶耐药菌株对iclaprim不敏感。这一结果提示，DHFR可能存在新的突变或存在其他导致iclaprim抗菌活性降低的机制。

在本课题研究中，iclaprim对MSSA（MIC50、MIC90：0.12、0.25 mg/L）的活性是甲氧苄啶（MIC50、MIC90：2、4 mg/L）的16倍，iclaprim对MRSA（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧苄啶（MIC50、MIC90：2、16 mg/L）的8～32倍；对MSSA，与甲氧苄啶-磺胺甲唑（MIC50、MIC90：0.06、0.12 mg/L）相比，iclaprim的活性稍弱，而对MRSA则与甲氧苄啶-磺胺甲唑相当（MIC90：0.5 mg/L）（ 表1）。但就金葡菌总体而言，iclaprim（MIC50、MIC90：0.25、0.5 mg/L）的活性是甲氧苄啶（MIC50、MIC90：2、8 mg/L）的8～16倍，这一数据也与国外的报道（8～32倍）基本一致[7]。

Huang等[22]报道，iclaprim对甲氧苄啶和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药金葡菌国际菌株（欧美、亚太、拉丁美洲、非洲、中东等地区）的MIC90分别为＞16 mg/L和＞8 mg/L。而iclaprim对上述同类药物耐药菌株同样具有较低的体外活性，MIC50、MIC90值分别达1、16 mg/L和＞16、＞16 mg/L。由此可见，对甲氧苄啶和甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药的菌株，也会显著增强对iclaprim耐药性，尤其是后者，其中原因需要进一步探讨。

总之，iclaprim作为一种新型DHFR抑制剂，对金葡菌有很好的体外抗菌活性，如与磺胺类药物联合使用效果会更好，可能具有广泛的应用前景。不过，研究中也发现了少量iclaprim MIC值较高的菌株，其机制仍需深入研究，为防控耐药菌株的出现和传播提供对策。