卵泡发育相关蛋白GPR173的理化性质及其结构预测分析

魏艳，文朝朝，王晰，王海龙，郭睿，赵虹，张栋，弓韬，孙公勤，于保锋

山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山西太原030001

影响育龄女性不育的因素很多，如卵泡发生、排卵、早期胚胎发生及植入等，卵巢早衰及卵巢卵泡发育缺陷导致的卵巢功能不全已成为女性生育能力的主要原因，该原因使约1%40岁以下的女性不育［1-2］。GPR173为一种高度保守的G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR），GPCR代表多种疾病的治疗靶标［3］。NGUYEN等［4］研究发现，GPR173及其配体与卵泡的发育有关，且随着卵泡的增长，在卵巢颗粒细胞中的表达也随之增加。因此，了解GPR173蛋白的功能对疾病的治疗至关重要。

菲尼克斯蛋白（Phoenix protein，PNX）为一种新发现的生殖肽，是GPR173其中一个潜在配体［5］。MATSUMOTO［6］等研究发现，因GPCR家族在脊椎动物物种中高度保守，也被称为脑部表达的超保守受体（super conserved receptor expressed in brain，SREB）家族，该家族成员至少包括SREB1、SREB2及SREB3，GPR173作为SREB亚家族的一部分，也称为SREB3，在脑部及卵巢中表达，尤其在人卵巢中高表达，并参与调节生殖性下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴［6］。营养水平及环境化学物质可能通过调节GPR173的表达而影响生殖功能，这很有可能是生殖健康的未来治疗目标［7］。PNX通过GPR173发出的信号以激活cAMP-PKA途径，诱导生殖基因的表达。同时，WANG等［8］研究发现，PNX作为下丘脑衍生的垂体启动因子，通过作用于下丘脑或垂体水平来调节HPG轴，进而在卵泡发生中发挥作用。目前，GPR173作为与卵泡发育有关的治疗靶点研究甚少。

本研究通过多种生物信息学在线软件对GPR-173蛋白的理化性质、结构功能及与其相互作用的蛋白进行分析，为进一步研究GPR173的作用机制及其作为治疗靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 GPR173氨基酸序列 从NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／）数据库中下载GPR173的氨基酸序列，序列如下：MANTTGEPEEVSGALSPPSASAYVKLVLLGLIMCVSLAGNAILSLLVLKERALHKAPYYFLLDLCLADGIRSAVCFPFVLASVRHGSSWTFSALSCKIVAFMAVLFCFHAAFMLFCISVTRYMAIAHHRFYAKRMTLWTCAAVICMAWTLSVAMAFPPVFDVGTYKFIREEDQCIFEHRYFKANDTLGFMLMLAVLMAATHAVYGKLLLFEYRHRKMKPVQMVPAISQNWTFHGPGATGQAAANWIAGFGRGPMPPTLLGIRQNGHAASRRLLGMDEVKGEKQLGRMFYAITLLFLLLWSPYIVACYWRVFVKACAVPHRYLATAVWMSFAQAAVNPIVCFLLNKDLKKCLRTHAPCWGTGGAPAPREPYCVM。

1.2 生物信息学预测分析 采用在线软件预测分析GPR173氨基酸序。ProtParam（https：／／web.expasy.org／protparam／）软件预测分析其理化性质；ProtScale（https：／／web.expasy.org／protscale／）软件分析其疏水性；SignalP-4.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）软件预测分析其信号肽结构；SecretomeP 2.0 server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）软件预测其分泌蛋白的类型；TMHMM 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）在线程序分析其跨膜结构；NetNGlyc 1.0 Sever（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）、NetOGlyc 4.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）及Yin OYang 1.2 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／YinOYang／）软件预测其N-糖基化位点和O-糖基化位点；Netphos 2.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos-2.0／）软件预测其磷酸化位点；PSORTⅡ（https：／／psort.hgc.jp／form2.html）软件分析预测其亚细胞定位；SOPMA工具（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／secpred_sopma.pl）分析预测其二级结构及各成分的占比；NCBI中Conserved Domain数据库分析其结构域；SWISS-MODEL建模服务器（https：／／swissmodel.expasy.org／）分析预测该蛋白的三维结构；STRING（https：／／string-db.org／）软件预测分析其蛋白的网络相互作用并进行基因功能（Gene Ontology，GO）注释。

2 结果

2.1 GPR173蛋白的理化性质 经ProtParam软件分析，GPR173蛋白的相对分子质量为41 481.40，分子式为C1911H2944N494O474S33，理论等电点PI为9.36，属碱性蛋白；组成GPR173的氨基酸有20种，其中丙氨酸（Ala）的含量最多，占比为13.1%，天冬氨酸（Asp）及谷氨酰胺（Gln）的含量最少，占比为1.9%，见图1；带正电荷的残基数为35个；带负电荷的残基数为18个；半衰期为30 h（哺乳动物网织红细胞）；不稳定系数为38.70，属稳定蛋白（不稳定系数<40）；脂肪系数为95.55，总平均亲水性为0.483。经ProtScale软件分析，GPR173氨基酸序列第31位疏水性最大值为3.144，第215位亲水性最大值为-2.722，整体亲疏水性预测显示，GPR173为疏水性蛋白，见图2。

图1 GPR173氨基酸组成及占比Fig.1 Amino acid composition and proportion in GPR173

图2 GPR173亲水性及疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of GPR173

2.2 GPR173信号肽 软件SignalP-4.0预测结果包含C值（表示剪切位点值）、S值（表示是否为信号肽）、D值（表示是否为分泌蛋白）及Y值（综合考虑C及S值的1个参数），如S均值高于0.5，认为存在信号肽；如D均值高于0.5，则可能为分泌蛋白。结果显示，GPR173蛋白第39位氨基酸处，C及Y值达最高，分别为0.183和0.161，在第36位氨基酸处，信号肽S值达最高点，为0.247，1～38位氨基酸序列的S均值为0.130，D均值为0.149，见图3。推测该蛋白不是经典型分泌型蛋白，也不存在信号肽序列。

2.3 非经典型分泌蛋白的预测SecretomeP 2.0 Server软件结果评价主要参考NN-score（非经典分泌蛋白的决定性评分），哺乳动物序列的NN-score阈值为0.6。结果显示，GPR173蛋白氨基酸序列的NN-score为0.126017，推测该蛋白不是非经典型分泌蛋白。

2.4 GPR173跨膜结构 结果显示，GPR173蛋白的氨基酸序列膜外（红线）至膜内（蓝线）的跨膜螺旋有4个，分别位于第26～48、98～120、188～210、321～343氨基酸上；膜内至膜外的跨膜螺旋有3个，分别位于第61～83、137～159、289～311氨基酸上；膜外蛋白（位于红线上）分别位于第1～25、84～97、160～187、312～320氨基酸上；膜内蛋白（位于蓝线上）分别位于第49～60、121～136、211～288、344～373氨基酸上。见图4。

图3 GPR173信号肽分析Fig.3 Analysis of signal peptide of GPR173

图4 GPR173跨膜结构分析Fig.4 Analysis of transmembrane structure of GPR173

2.5 GPR173亚细胞定位 经PSORTⅡ软件分析，GPR173定位于不同的细胞器，由大到小的概率依次为质膜占56.5%，内质网占21.7%，空泡占8.7%，线粒体占4.3%，高尔基体占4.3%，细胞核占4.3%。GPR173在质膜上占比最大，与预测的跨膜蛋白结果一致。

2.6 GPR173翻译后位点修饰GPR173翻译后经NetNGlyc 1.0 Server分析，N-糖基化位点分别在第3及184位氨基酸上；经NetOGlyc 4.0 Server分析，O-糖基化位点分别在第4、5及12位氨基酸上，再经YinOYang 1.2 Server分析，O-糖基化有7个位点，分别位于第5、12、19、88、139、238及360位氨基酸上。经Netphos 2.0 Server分析，GPR173翻译后有5个Ser、1个Thr及4个Tyr均可能是蛋白激酶的磷酸化位点。

2.7 GPR173的空间结构 经SOPMA软件分析，GPR173的二级结构由38.87%的无规卷曲、46.92%的α-螺旋、12.06%的延伸链（β折叠）及2.14%的β-转角组成，其中α-螺旋占比较高，是其主要结构，见图5。经Conserved Domain数据库分析，GPR173蛋白属7tm_GPCRs超家族，且含1个7tmA_SREB3_GPR173结构域，见图6。经SWISS-MODEL分析，GPR173蛋白的三维结构中GMQE为0.56，QMEAN为－6.06，序列相似度为30%，见图7。

2.8 GPR173的相互作用蛋白 结果显示，与GPR173蛋白可能有10个相互作用的蛋白，分别为SMIM2［相互作用的可靠程度（score）：0.669］、TMEM87B（score：0.579）、TSPYL2（score：0.463）、EFHC1（score：0.566）、T HOP1（score：0.516）、GPR157（score：0.511）、GPR174（score：0.575）、GPR144（score：0.596）、GPR176（score：0.538）及GPR20（score：0.477），见图8。由此推测，GPR173与SMIM20相互作用的可能性最大，与GPR20相互作用的可能性最小；SMIM20、TMEM87B、TSPYL2、EFHC1及THOP1与GPR是GPCR信号通路的关键分子，GPR173可能参与GPCR信号通路进而发挥其作用。经GO分析，GPR173作用蛋白基因参与GPCR信号通路、昼夜行为及正调节磷脂酶C激活GPCR信号通路的细胞溶质钙离子浓度，见表1。

图5 GPR173二级结构分析Fig.5 Analysis of secondary structure of GPR173

图6 GPR173功能结构域分析Fig.6 Analysis of functional domain of GPR173

图7 GPR173三维结构预测Fig.7 Prediction of three-dimensional structure of GPR173 protein

表1 GPR173蛋白的GO分子功能和生物学过程分类Tab.1 Classifications of GO molecular function and biological process of GPR173 protein

3 讨论

研究表明，PNX治疗增加了卵母细胞数量并改善其细胞的成熟度［6］。有报道表明，较大的卵泡与卵母细胞质量的改善相一致，PNX可能通过协助卵泡生长来提高卵母细胞成熟度［4，9-10］，由于PNX及GPR173均在卵母细胞中显著表达，因此并不排除PNX与GPR173直接作用于卵母细胞，进而影响卵泡发育。本研究分析显示，GPR173是一种碱性稳定的疏水蛋白，无信号肽，既不是经典的分泌蛋白，也不是非经典分泌型蛋白，有7个跨膜结构域，ɑ-螺旋是其二级结构的主要形式，属7tm_GPCRs超家族。

糖基化是常见且重要的蛋白翻译后修饰方式，广泛存在于蛋白中，对蛋白结构及功能具有重要的调控作用，为一种普遍的生命活动调节方式，在细胞信号转导过程中起重要作用［11-12］。利用多种不同在线生物信息学软件对GPR173蛋白的糖基化预测表明，GPR173蛋白在第3及184位存在N-糖基化位点，两种软件对O-糖基化的分析结果存在不同，但在第5及12位存在共同的O-糖基化位点。GPR173翻译后修饰（post-translation modification，PTM）的另1个潜在位点是细胞外N-末端尾部的天冬酰胺残基，该位点是N-糖基化的候选位点，其可促进受体与细胞外环境的相互作用或协助配体募集，而所提及的PTM是否与GPR173的功能及活性有关是未知的［13］，该预测可能在细胞生理活动中及其疾病的作用机制中起重要作用。

GO分析显示，GPR173相互作用蛋白基因主要参与的分子功能是受体活性激活；研究表明，GPCR及其介导的信号通路在脊椎动物神经系统发育及卵巢颗粒细胞增殖与卵巢卵泡发育过程中有一定的作用［14］。GPCR介导的信号通路主要包括cAMP信号通路及磷脂酰肌醇信号通路，cAMP信号通路主要通过腺苷酸环化酶调节胞内cAMP的信号水平；而磷脂酰肌醇信号通路则是通过膜受体接受胞外信号，同时产生2个胞内信使，分别激活IP3-Ca2+及DG-PKC途径，实现细胞应答。研究表明，皮质醇昼夜变化对卵泡发育也有一定的影响［15］。

PNX及GPR173均是维持生殖功能所必需的蛋白，其mRNA水平随着年龄的增加而增加［16］。有研究表明，外源性施用的PNX作用于脑部，用以刺激黄体生成素（luteinizing hormone，LH）在排卵前分泌激增，但在GPR173弓状核表达受损时，不会发生上述效应［17］，表明GPR173是PNX在大脑中对生殖激素分泌作用所必需的蛋白，也可能GPR173仅仅作为PNX受体或在激活的神经回路的下游表达［18］；另一种原因可能是GPR173与PNX相互作用对生殖激素的分泌起作用，如其中1个蛋白受损或减少就会使其作用减弱。

本文通过生物信息学软件对GPR173蛋白的结构以及其他特点进行分析，为研究该蛋白在疾病中的机制奠定了基础，且有可能将其作为未来生殖障碍的一个新的治疗靶点。