血管细胞黏附分子-1对脑心肌炎病毒体外增殖的影响及其作用机制

李生军，张海霞，王兴陇，李倩，包晓婧，李向茸，冯若飞

1.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030；

2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030

脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的以脑炎、心肌炎、心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病，可感染猪等哺乳类动物及灵长类动物［1-2］。1945年，首次分离获得EMCV，1958年EMCV感染确定为猪的致死性病因之一［3-4］。EMCV感染宿主的范围较广，其中仔猪致病率和致死率较高，其暴发流行对人类公共卫生及养殖产业均造成了较大影响［5］。EMCV为无包膜单股正义链RNA病毒，病毒粒子直径约30 nm，呈球形，蛋白质分子量约2 600 ku［6］。EMCV基因组包含4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7种非结构蛋白，结构蛋白均参与病毒抗原表位的形成，其中VP1是最重要的中和性抗原表位，还与病毒粒子表面的拓扑结构、抗原性、受体吸附及脱壳密切相关；VP2上存在的2个B细胞线性表位也有一定的免疫活性［7］。

血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）属于免疫球蛋白超家族，又称为CD106［8］，广泛表达于内皮细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞等细胞表面［9］。研究表明，VCAM-1不仅参与机体的免疫反应、炎症反应、肿瘤的发展及转移等多种病理生理过程，也参与多种病毒感染机制，如巨细胞病毒、肠道病毒71型［10-14］。HUBER［15］研究证实，VCAM-1参与EMCV的感染过程，但未见VCAM-1对EMCV增殖调控作用的相关报道。本研究通过探讨VCAM-1对EMCV体外增殖的影响及其作用机制，以期为EMCV感染相关疾病的治疗及其相关疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、质粒、细胞及基因EMCV GS-01株、感受态E.coliBL21（DE3）、载体pcDNA3.1、表达质粒pcDNA3.1-VCAM-1、pET30a-VP1（含His标签）、pET30a-VP2（含His标签）、pET30a-VP3（含His标签）及pGEX-6P-1-VCAM-1（含GST标签）由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室保存；C2C12小鼠成肌细胞由甘肃省动物技术创新中心提供；siNC（5′-UUCUCCGAA-CGUGUCACGU-3′）和siVCAM-1（5′-GGATAATCCT-GAAGAAGAA-3′）均由广州瑞博生物科技有限公司设计及合成。

1.2 主要试剂 胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；质粒小提试剂盒、RNAiso plus细胞／细菌总RNA提取试剂盒、高纯质粒小提试剂盒、TIANScript M-MLV及TaqDNA聚合酶均购自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Select Master Mix试剂盒购自美国ABI公司；LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司；ECL显色试剂盒购自美国Perkin-Elmer公司；兔抗VCAM-1单克隆抗体及鼠抗β-actin单克隆购自美国Abclonal公司；兔抗His单克隆抗体及鼠抗GST单克隆抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG购自美国Jackson公司；Easy Pure Quick Gel Extraction Kit购自北京全式金生物技术有限公司；Pierce GST protein Interaction Pull-down Kit购自美国Thermo公司。

1.3 引物设计及合成 根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列（X67783.1），应用Primer Premier 5.0软件设计qPCR检测用引物（VCAM-1-qF／R）、内参引物（mGAPDH-qF／R）、EMCV检测用引物（EMCVLZD-F／R）及探针（EMCV Probe）［16］，见表1。引物及探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物及探针序列Tab.1 Sequences of primers and probes

1.4 EMCV感染时间对C2C12细胞中VCAM-1表达水平影响的检测 将C2C12细胞按1×106个／孔接种于6孔板，用含10% NBS的DMEM培养基于37℃培养18～24 h；待细胞密度达90%时，将EMCV按MOI=0.001感染，同时设未感染组，于37℃感染24和48 h，收取细胞。采用RNAiso plus试剂盒提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，以其为模板，进行qPCR扩增，扩增条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，共40个循环。采用RIPA裂解细胞，经15% SDS-PAGE分离蛋白后，电转移至PVDF膜，加入兔抗VCAM-1单克隆抗体（1∶3 000稀释）及鼠抗β-actin单克隆抗体（1∶5 000稀释），于室温孵育2 h；TBST洗涤5次，加入HRP标记的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG（1∶10 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗涤5次，ECL法显色。

1.5 过表达VCAM-1对EMCV体外增殖影响的检测按1.4项方法培养C2C12细胞，待细胞密度约达80%时，在LipofectamineTM2000的介导下，将2μg pcDNA3.1和pcDNA3.1-VCAM-1分别转染C2C12细胞，于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，qPCR及Western blot法（同1.4项）检测VCAM-1过表达情况。再将EMCV按MOI=0.001感染，继续培养24 h，收集细胞及上清液，反复冻融3次，于4℃，943×g离心10 min，取上清液，参照文献［16］的qPCR法和TCID50法分别检测病毒拷贝数和病毒滴度。

1.6 抑制VCAM-1表达对EMCV体外增殖影响的检测 按1.5项方法将150 nmol／L siNC和siVCAM-1分别转染C2C12细胞，于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，qPCR及Western blot法（同1.4项）检测VCAM-1抑制表达情况。再按1.5项方法感染EMCV，并检测病毒拷贝数及病毒滴度。

1.7 VCAM-1与EMCV结构蛋白间相互作用的检测将表达质粒pET30a-VP1、pET30a-VP2、pET30a-VP3及pGEX-6P-1-VCAM-1转染至感受态E.coliBL21（DE3），用LB培养基于37℃中培养12 h；按1∶100的比例转接至新鲜LB培养基，继续培养至A600为0.6时，加入终浓度为0.5 mmol／L的IPTG，于28℃诱导24 h，收获表达产物。采用Pierce GST protein Interaction Pull-down Kit试剂盒将含有GST标签的VCAM-1融合蛋白固化在树脂上，用预冷的PBS洗涤10次，加入2 mL蛋白结合缓冲液，冰浴30 min；分别加入含有His标签的VP1、VP2和VP3融合蛋白，用预冷的蛋白结合缓冲液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol／L NaCl）洗涤10次，加入1 mL洗脱液（50 mmol／L Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol／L NaCl，10 mmol／L还原性谷胱甘肽），室温振荡30 min，收集产物。经Western blot法检测VCAM-1与病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3之间的相互作用，方法同1.4项，其中一抗为鼠抗GST单克隆抗体（1∶3 000稀释）及兔抗His单克隆抗体（1∶5 000稀释）。

1.8 统计学分析 应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，所有数据均采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素ANOVAs或t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EMCV感染时间对C2C12细胞中VCAM-1表达水平的影响 与未感染组比较，EMCV感染C2C12细胞24 h时，感染组VCAM-1基因mRNA转录水平及VCAM-1蛋白表达水平差异均无统计学意义（t=0.845，P>0.05）；感染48 h时，感染组VCAM-1基因mRNA转录水平及VCAM-1蛋白表达水平均明显降低（t=10.61，P<0.001）。见图1及表2。表明C2C12细胞内VCAM-1蛋白的表达水平随着EMCV感染时间的延长明显降低。

图1 Western blot法检测C2C12细胞感染EMCV后VCAM-1蛋白的表达情况Fig.1 Western blotting of expression of VCAM-1 in C2C12 cells infected with EMCV

表2 C2C12细胞感染EMCV后VCAM-1基因mRNA转录及VCAM-1蛋白表达水平Tab.2 The mRNA transcription and VCAM-1 protein expression levels of VCAM-1 gene in C2C12 cells after EMCV infection

2.2 过表达VCAM-1对EMCV体外增殖的影响pcDNA3.1-VCAM-1转染组及pcDNA3.1转染组C2C12细胞中VCAM-1基因mRNA转录水平分别为9.97和1.05，VCAM-1蛋白表达水平分别为1.84和0.90，见图2。pcDNA3.1-VCAM-1转染组C2C12细胞中VCAM-1基因mRNA转录水平及VCAM-1蛋白表达水平明显高于pcDNA3.1转染组（t=14.35，P<0.01）。感染EMCV后，pcDNA3.1-VCAM-1转染组及pcDNA3.1转染组C2C12细胞EMCV病毒拷贝数分别为3.45×108和3.02×109，病毒滴度分别为10-3.37和10-4.96TCID50／mL。与pcDNA3.1转染组比较，pcDNA3.1-VCAM-1转染组EMCV病毒拷贝数及病毒滴度均显著降低（t分别为13.59和12.55，P<0.001）。表明过表达VCAM-1可抑制EMCV增殖。

图2 Western blot法检测C2C12细胞中VCAM-1蛋白的过表达情况Fig.2 Western blotting of overexpression of VCAM-1 in C2C12 cells

2.3 抑制VCAM-1表达对EMCV体外增殖的影响siNC转染组和siVCAM-1转染组C2C12细胞中VCAM-1基因mRNA转录水平分别为1.10和0.18，VCAM-1蛋白表达水平分别为2.20和1.11，见图3。siVCAM-1转染组C2C12细胞中VCAM-1基因mRNA转录水平及VCAM-1蛋白表达水平明显低于siNC转染组（t=51.08，P<0.001）。感染EMCV后，siVCAM-1转染组及siNC转染组C2C12细胞EMCV病毒拷贝数分别为6.72×107和5.57×106，病毒滴度分别为10-5.3和10-3.8TCID50／mL。与siNC转染组比较，siVCAM-1转染组EMCV病毒拷贝数及病毒滴度均显著升高（t分别为13.23和12.99，P<0.001）。表明抑制表达VCAM-1可促进EMCV增殖。

图3 Western blot法检测C2C12细胞中VCAM-1蛋白的抑制表达情况Fig.3 Western blotting of inhibition of VCAM-1 in C2C12 cells

2.4 VCAM-1与EMCV结构蛋白间的相互作用加入融合蛋白GST-VCAM-1的Pull-down收获液及Input收获液均可与鼠抗GST单克隆抗体发生特异性结合，表明GST-VCAM-1成功固化在树脂上。加入融合蛋白His-VP1、His-VP2或His-VP3的Input收获液均可与兔抗His单克隆抗体发生特异性结合，加入His-VP1、His-VP2的Pull-down收获液可与兔抗His单克隆抗体发生特异性结合，加入His-VP3的Pull-down收获液未见该结合条带，见图4。表明VCAM-1与病毒蛋白VP1和VP2有明显的直接相互作用，与VP3无相互作用。

1：VP1；2：VP2；3：VP3。

3 讨论

多年来，已在多个国家相继报道了EMCV感染的暴发和流行，主要引起孕猪流产、死胎、弱胎及仔猪的急性、致死性脑炎、心肌炎等疾病，严重威胁养猪业的经济发展［17-18］。

相关研究发现，血管内皮细胞损伤是病毒性脑炎发病的一个主要机制，正常情况下非活化内皮细胞中VCAM-1呈不表达或低表达，当受到外源因子刺激或诱导后，组织、器官会产生各种病变，一般是从黏附分子的过量表达开始［19-20］。作为主要的两种黏附分子，细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）和VCAM-1可使细胞之间或与基质之间发生黏附，主要参与细胞生长、分化及与疾病相关的炎性反应［21-22］。研究表明，高表达VCAM-1可与整合素家族的极晚期抗原-4（very late antigen-4，VLA-4）相互作用，发挥炎症性损伤作用［23］。VCAM-1还与血栓形成、心功能衰退等疾病相关［24］。研究发现，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱发的心肌炎性反应中，ICAM-1和VCAM-1表达显著上升，该反应主要通过I-κB的磷酸化和降解，从而释放、活化NF-κB p65，过量表达的ICAM-1和VCAM-1可加重炎性反应［22］。目前针对VCAM-1的研究基本上均与疾病的发展进程相关，如VCAM-1参与免疫细胞的黏附和迁移，VCAM-1与配体结合后具有加强黏附的作用，可促进炎性细胞的运动和迁移等，表明VCAM-1在炎症、肿瘤转移等病理过程中发挥重要作用［25-26］。

本研究通过检测EMCV感染后C2C12细胞内VCAM-1的表达情况，结果表明，C2C12细胞内VCAM-1基因转录及VCAM-1蛋白的表达水平随着EMCV感染时间的延长明显降低（P<0.001），验证了EMCV感染可抑制VCAM-1在细胞内的表达。进一步检测过表达及抑制表达细胞内VCAM-1对EMCV增殖的影响，结果显示，过表达VCAM-1可明显抑制EMCV增殖（P<0.001），抑制VCAM-1表达可促进EMCV增殖（P<0.001）。为验证VCAM-1与EMCV结构蛋白之间的相互作用，选取病毒蛋白VP1、VP2及VP3进行原核表达，利用带GST标签的VCAM-1作为诱饵蛋白，进行Pull-down验证，分别捕获含有His标签的VP1、VP2、VP3蛋白，结果显示，VCAM-1与VP1、VP2存在明显的相互作用，与VP3无相互作用。综上所述，VCAM-1对EMCV体外增殖发挥抑制作用，可能是通过VCAM-1与EMCV结构蛋白VP1、VP2的相互作用实现的。本实验为EMCV感染相关疾病的治疗及其相关疫苗的研发奠定了基础。