Ⅰ型登革病毒在中国的传播及进化

李代英，鲁明，朱海莲，何丽存，顾冉，张娟，陈俊英，潘玥，孙强明

1.中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明650118；2.云南省虫媒传染病防控研究重点实验室，云南 普洱665000

登革病毒（Dengue virus，DENV）是一种单链正义RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，其开放阅读框架编码衣壳蛋白、膜相关蛋白和包膜蛋白3种结构 蛋 白 以 及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等7种非结构蛋白，由伊蚊传播，主要发生在热带和亚热带地区。估计每年约3.9亿人感染登革热，其中9 600万人感染后症状明显，是在世界范围内广泛传播的虫媒病毒［1］。登革热的流行传播每年造成巨大的经济损失并对人体健康产生了巨大的威胁。在我国，首次于1978报道了较大规模的登革热疫情，而Ⅰ型DENV（Dengue Virus-1，DENV-1）是国内的主要流行病毒株之一，在广东、湖南、云南等地多次报道了由DENV-1引起的疫情。DENV有4种不同的血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。登革热感染者在第1次感染后再次感染登革热时，如果血清型与第1次感染类型不同，将产生抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement，ADE）导致感染加重，引起广泛的临床表现。在一个地区内存在多种血清型的DENV流行传播时，疫情的范围和患者的症状将更加严重。临床症状的范围由轻到重，从发热到登革热出血热（Dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革热休克综合征（Dengue shock syndrome，DSS）变化。严重的症状会导致生命受到威胁。至今为止，尚无应对登革热的合适的人用疫苗和特效疗法，且防疫工作水平有待提高，无法阻止登革热疫情的出现和快速传播。登革热疫情的扩散和传播对公共卫生和经济发展造成了沉重的经济负担，导致全球疾病的负担日益加重，登革热由此被认为是发病率最高、危害最大的传播媒介疾病［2］。登革热疫情多在热带和亚热带地区暴发，其炎热多雨的环境为蚊虫滋生提供了有利条件，是这一现象出现的诱因之一［3］。在我国南方地区，如广东、云南、海南具有登革热传播环境的省份相继出现了登革热疫情。根据HUANG等的研究［4］，广东省在2014年暴发的登革热疫情大多数是由DENV-1导致的。本文汇总了GenBank上以“China”和“Virus 1”为关键词的搜索结果，通过收集来自中国的DENV-1基因组全序列来分析DENV-1的流行趋势、传播方向和遗传进化特征，旨在为后续研究DENV的传播及防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 DENV流行株全长核酸序列的获取 在美国国家生物信息中心NCBI进行DENV序列的收集，病毒株收取地点为中国，共收集DENV-1全长序列株405株，涵盖了1985—2020年间大部分中国境内提交的病毒株序列。

1.2 DENV流行株全长序列初步进化分析及代表株的挑选 对所收集的DENV序列株进行描述和初步分析，通过比对和系统发育分析构建系统发育树来揭示其在中国地区的遗传进化和流行病学信息。由于需要进行大规模的序列比对和进化树的绘制，因此使用RaxML构建系统发育树。从NCBI的GenBank数据库搜索国内流行的DENV-1全基因序列并汇总下载，用在线MAFFT工具（https：／／mafft.cbrc.jp／alignment／server／）提交得到返回的比对结果。然后使用Mesquite软件打开比对后的文件以phylip格式输出，并将该格式输出的文件在ATGC网站（http：／／www.atgc-montpellier.fr／phyml／）在线进行系统发育树的构建，模型选择为GTR+I+R［5］。从进化树的分析结果中筛选出在支系、时间、地区有代表性的登革热流行株，并与东南亚地区提交的DENV-1全长序列株共48株使用MEGA X软件进行进化树绘制（选用的代表性DENV-1流行株见表1），采用Maximum likelihood模型，Bootstrap Replications设置为1 000［6-8］，以此结果进行第2轮分析。

表1 MEGA进化树选用的代表性DENV-1流行株Tab.1 Representative epidemic DENV-1 strains used for MEGA phylogenetic tree

1.3 重组进化分析 由于重组是DENV的一种相对频繁的进化机制，本文使用RDP5（recombination detection program 5）挑选了上一步绘制系统进化树中具有地理位置和年份代表性的毒株进行重组和演化分析［9］。将所选病毒株在MEGA X软件中使用Clustal W方法比对并对齐所选序列株，将其结果输出为MEGA format格式，随后在RDP5中运行进行重组分析。

1.4 DENV-1流行株氨基酸突变位点分析 将1.2项中挑选的具有代表性的48株DENV-1流行株的序列比对结果进行汇总分析，通过MEGA X软件将开放阅读框架翻译为氨基酸序列，分析氨基酸突变情况。

2 结果

2.1 中国DENV-1的时间及地区分布 根据公共卫生科学数据中心（http：／／www.phsciencedata.cn／Share／）的数据统计，2004—2017年间共66 623人感染登革热。在此期间广东省是登革热流行最严重的省份，作为沿海省份并拥有温暖潮湿的气候，为登革热的传入和蚊虫的滋生创造了有利条件；沿海的浙江和边境省份云南同样经常出现DENV-1流行株的传播。见图1。

图1 中国登革热感染人数及DENVⅠ型血清型地区历年分布Fig.1 Annual distribution of case number of DENV infection and provinces with DENV-1 epidemic in China

2.2 中国境内DENV流行株的序列进化分析405株进化树收录的DENV株中近300余株均由广东省上传，可见在DENV株的输入和传播过程中，广东省起到了关键作用。2016年广东株MN018318和MG840567与2株台湾流行株KY496855、KY496854在发育树中距离相近。在图2进化树中，MF681692至KU509257之间的流行株表明各个省份流行的DENV株与彼此之间以及东南亚国家存在密切联系。初步分析绘制的进化树中，MG840579、MG84-0574等2017年越南株与上述2016年广东流行株接近，提示可能存在广东省向东南亚地区输出DENV的可能，而非东南亚地区对我国的单向输入。2019年（MN923080）、2017年（MN018297）、2016年（MN-018318／MG840567）以及2010年（KT827367）广东流行株在遗传距离上相近，提示某一病毒株输入后可能长期流行，并且会随着时间延长积累更多样的DENV株，在核苷酸序列和基因型上更加丰富，为防控及疫苗研发工作带来困难。同样的在图2进化树中，MF405201、KY672943、MW386867分 别 为 云 南2013—2015年间流行的病毒株，云南省DENV-1流行株与东南亚国家流行株显著相关，在遗传距离上相近，且大多数与广东省主要流行株处于不同的分支，可认为云南省DENV流行株多自中南半岛的内陆国家输入，而广东省的DENV流行株输入来源更为广泛。在2014年暴发的登革热疫情中，广东省提交的病毒株数量较多且联系评分降低，可认为该年份因大量不同支系的登革热传入并共同在同一地区流行引发了登革热大规模的流行。

图2 中国境内流行的DENV-1全基因组序列与东南亚流行株构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of complete genome sequences of DENV-1 in China and epidemic strain in Southeast Asia

2.3 中国DENV-1流行株的重组进化分析 在支系、省份、时间上有代表性的DENV株为MN018318、MG840567、KT827367等广东DENV流行株14株（1991—2018年），以及台湾流行株如KX951689（2016）和云南流行株MF681692（2019）、福建流行株DQ193572（2005）、浙江流行株如AY835999（2004）等DENV株共计24株，进行重组分析，结果显示，2017年广东株MN018297部分序列可能与2014年广东流行株KP723476同源，表明中国境内的DENV株可能存在极少量的重组进化的现象，但并未出现大范围的DENV株之间的序列重组。见图3。

图3 DENV-1株基因重组进化分析Fig.3 Analysis of gene recombination evolution of DENV-1 strain

2.4 DENV-1流行株氨基酸突变位点分析 将挑选的具有代表性的48株DENV-1氨基酸序列进行比对分析，从表2可知，除氨基酸中E蛋白区域的317、368、441、649点位出现氨基酸的替代外，非结构蛋白区域的1053、1274、1337、1768等位点也均出现了不同比例的氨基酸的替代。其中317、441、649、873、903、914、1274、1275、1289、1587、2113等位点主流氨基酸比例与替代氨基酸比例约为7∶3，而在占比30%的氨基酸替代情况中，KP723473（广东2014）等6株、KP686070（河南2014）、KR024705（湖北2014）、KR024708（浙江2014）、KT827378（广东2015）等2株、KX225487（广东2013）等2株、MN886849（浙江2019）等2株的存在导致了这一比例的出现，由于这一部分序列极为接近，结合图1，可推测认为2014年广东暴发的登革热疫情将传播范围扩大至河南、湖北、浙江等地，且该毒株可能并非2014年由境外输入，而是于2013年已经在广东省内流行，并在之后的数年内仍然长期在广东流行。这一轮输入的毒株并非与云南省及周边地区的流行株序列相接近，可支持云南省和广东省的DENV流行株是由不同来源输入的结果。869、1053、1337、1768等替代位点的存在提示可能有第3种类群的DENV流行株存在但占比不高，可能是由于新的输入方式、DENV序列株的丰富或重组而出现这一现象。

表2 DENV-1流行株氨基酸突变位点分析（%）Tab.2 Analysis of amino acid mutation sites of epidemic DENV-1 strains（%）

3 讨论

从1978年国内首次报道了广东省登革热流行，至今已经40余年，登革热的流行已经从沿海及边境地区的广东省、海南省、云南省、福建省等不断向北扩展，目前浙江、湖南、河南等地均已出现过规模不等的登革热流行［10-11］。且云南、湖南等内陆省份已经出现某一基因型每年固定的流行传播［12-14］。其中DENV-1毒株多次在国内引发了大规模的疫情，而4种血清型的DENV在中国境内均被检测到，特别是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，在国内交替引起登革热疫情。多种型别的DENV毒株共同流行的情况也有出现，且多种型别DENV毒株的同时流行会导致疫情的规模更大、临床症状更重，影响更加严重［15］。

目前在登革热尚无合适的人用疫苗的情况下［16］，通过病媒控制等预防手段来控制登革热疫情仍然是最有效的方法。东南亚地区以及我国南方的气候环境和人群喜爱花草的生活习惯均为登革热的传播提供了有利条件，这也为各种DENV基因型在一定地区的长期流行和累积提供了适宜环境。考虑到广东、广西、江西、湖南等省份气候相似而疫情暴发相比广东较为少见，推测境外传入因素在登革热的疫情暴发中起到了重要作用。在系统发育树的分析中，可以观察到同一支系下数株关系接近的DENV毒株是同一地区不同年间的持续流行的现象，即便每年有传入的DENV毒株，但因缺少快速传播的竞争环境和地理因素，之前国内所流行的不同支系的DENV毒株仍将流行很长一段时间并且难以消除，在该地区出现多种不同基因型的DENV同时流行时将会对疫情防控提出更严重的挑战，并且可能因不同血清型病毒的继发性感染和ADE作用导致重症病例数增加［17］，并且ADE会对DENV毒株传播竞争存在一定的选择性［18］，这对在早期曾经感染过登革热的人群威胁更大［19］。在国内DENV毒株的流行中，可以观察到许多基因型首先在广东、云南或者同时在广东、云南和内陆某一省份出现，且形成了稳定的进化谱系。考虑省份之间的交流和地理位置的特殊性，对广东省及云南省进行严格的疫情防控有助于从源头降低DENV毒株从境外的输入数量和在境内的扩散传播。

世界卫生组织2012—2020年的预防和控制登革热的全球战略目标是至少降低50%登革热死亡率、25%的发病率［20］。为达成这一目标和保护人群健康，需要认识登革热的传播程度和影响范围，并采取相对应的措施。作为疫情防控最有效的手段，目前登革热疫苗相关的研究正取得较大进展，虽然CYDTDV（Dengvaxia）四价嵌合减毒在2017年12月被菲律宾全面撤回，但日本武田（Takeda）DENVax、NIAID／Butantan的LAV Delta 30、Hawaii Biotech／Merck的DEN-80E、美国海军研究中心的D1ME-VR-P等均已处于临床研究阶段［21］，相信不远的将来将会取得重要突破。