免疫比浊法测定血清淀粉样蛋白A的钩状效应及其解决方案

朱 雨 梁忠柱 张甲波 徐 运 胡苗苗 吴泽东

安徽伊普诺康生物技术股份有限公司，安徽合肥 230000

血清淀粉样蛋白A（SAA）是由肝细胞分泌的一种急性反应蛋白，是临床上诊断病毒、细菌感染等重要指标[1]。机体感染时，SAA 短时间内浓度快速上升，病原体清除后又迅速恢复到正常水平，具有快升快降的特点，临床检测中容易出现高剂量钩状效应，导致假阴性现象的发生[2]。因此在研制SAA 检测试剂盒及其临床应用中，必须注意并设法解决钩状效应[3]。本研究报道了研制SAA 试剂盒及临床检测实践中，由于钩状效应而导致的假阴性现象，并提出解决方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标本来源：83 个定值血清，购自西门子医疗系统有限公司。仪器：美国贝克曼库尔特AU680 全自动化学分析仪。试剂盒：安徽伊普诺康生物技术股份有限公司生产的SAA 检测试剂盒（乳胶增强免疫比浊法，批号2019040101）、其他公司的SAA 检测试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 SAA 试剂盒的线性范围分析 采用西门子定值血清样本，通过倍比稀释的方式，稀释成5 个不同梯度浓度，每个稀释浓度样本测定2 次，分别求出测试结果的均值。以稀释浓度为自变量，以测定结果均值为因变量求出线性回归方程，同时计算线性绝对偏差或相对偏差。

1.2.2 SAA 试剂盒的准确度分析 选取高、低两个不同水平的定值血清样本进行测试，每个浓度的样本重复测定3 次，计算实测值与样本定值偏差大小，评定准确度。

1.2.3 SAA 试剂盒的精密度分析 选取高、低两个不同水平的定值血清样本进行测试，每个浓度重复20 次，最终计算其平均值、标准偏差、精密度大小，评定精密度。

1.2.4 定值血清的SAA 检测 用SAA 试剂盒检测83 份定值血清样本的SAA，用美国贝克曼库尔特AU680 全自动化学分析仪分析数据，按试剂说明书步骤操作。根据测定结果，以定值血清数据为参照，进行测定数据与定值血清数据相关性分析。

1.2.5 钩状效应分析 取超高值样本定值血清，用研发的SAA 试剂盒和其他公司的SAA 试剂盒同时检测SAA，分析检测SAA 高值样本时是否会出现钩状效应，并用Excel 表格做出相应的散点图和趋势线。

1.2.6 勾状效应解决方案 将53、59 和61 这3 个高值样本用9 g/L 氯化钠溶液进行梯度倍比稀释，每稀释一次都重新进行测定，直到稀释后的样本测定值在线性范围内（1 ～200 mg/L），将样本的定值浓度除以相应的稀释倍数设定为样本理论定值，根据稀释后测定值与理论定值是否一致，判断稀释法是否能解决钩状效应。

2 结果

2.1 SAA试剂盒的线性范围分析

在1 ～200 mg/L 浓度范围内，理论定值与实测均值相近，偏差均＜3%。见表1。由图1 可见，在1 ～200 mg/L 浓度范围内，样本梯度稀释后，实测均值与理论定值的相关性好，相关系数r=0.9997，大于所规定的0.975。因此，试剂的线性范围为1 ～200 mg/L，线性范围较宽，有足够的应用优势。

表1 SAA试剂盒线性范围测定

图1 线性范围内实测均值与理论定值的相关性分析

2.2 SAA试剂盒的准确度分析

高、低两个不同水平的定值血清样本所测定的SAA 数值与样本定值之间的偏差在20%以内，具有较高的准确度[4]。见表2。

表2 准确度分析结果

2.3 SAA试剂盒的精密度分析

检测高、低两个不同水平样本的重复性，其精密度CV 均＜3.0%，具有较高的精密度[5]。见表3。

2.4 定值血清的SAA检测

测定值与定值偏差过大的样本，如样本53、59、61 所测定的数据明显低于西门子定值，同时对于SAA 超高值的检测，出现检测结果变小的现象。见 表4。由图2 ～ 3 可见，样本53、59、61 的数据明显偏离回归方程式，当剔除三个偏离样本，在进一步进行相关性分析时，得到的回归方程为Y=1.4363x-1.6883，r=0.9948，相关系数r＞0.975，数据的相关性很好，表明53、59、61 三个样本的测定数值存在异常，可能为钩状效应所致。

表3 精密度分析结果

表4 部分定值血清的测定结果与定值比较

图2 定值血清的测定值与定值的相关性分析

图3 剔除偏离样本后定值血清的测定值与定值的相关性分析

2.5 钩状效应分析

用研制的SAA 试剂盒检测超高值SAA 定值血清，与其他公司的SAA 试剂检测结果比较，做出相应的散点图，见图4 ～6。1 ～1000 mg/L 浓度范围的定值血清拟合曲线图中，两种SAA 试剂在1 ～200 mg/L 的浓度范围内其定值和实测值基本一致，而超出200 mg/L 的测定值明显低于定值，但拟合曲线未出现明显的下降趋势。而在1 ～2000 mg/L、1 ～3000 mg/L 浓度范围定值血清的拟合曲线图中，浓度范围超出500 mg/L 的测定值与定值相差甚远，且整体曲线有明显的下降趋势，明显存在钩状效应。

图4 浓度范围1 ～1000 mg/L 定值血清的SAA 检测结果拟合曲线图

图5 浓度范围1 ～2000 mg/L 定值血清的SAA 检测结果拟合曲线图

图6 浓度范围1 ～3000 mg/L 定值血清的SAA 检测结果拟合曲线图

2.6 稀释法解决钩状效应

对样本53（定值1250.0 mg/L）、59（定值412.8 mg/L）、61（定值883.2 mg/L）进行倍比稀释并测定，直至测定值在SAA 试剂的线性范围内（1 ～200 mg/L）。样本53、59、61 在稀释16 倍之后，测定值与理论定值基本一致，表明稀释法能够成功解决钩状效应产生的影响。见表5。

表5 稀释法解决钩状效应结果

3 讨论

免疫比浊法是将比浊法和免疫反应结合起来的检测方法[6-7]，反应体系中的抗原抗体只能在合适比例范围内发生免疫凝集反应，当抗体或者抗原过量时会导致假阴性或者弱阳性的现象，即钩状效应[8]。有文献报道在检测甲胎蛋白时，发现3 例由于钩状效应而导致的错误结果[9]，也有报道提示钩状效应会导致强阳性样本易误测为弱阳性样本[10]。钩状效应不仅发生在免疫比浊检测中，在免疫法检测中普遍存在[11]，而临床上钩状效应的发生，会导致检测结果出现假阴性或弱阳性，从而影响诊疗，所以对于临床上钩状效应的解决至关重要[12]。

SAA 是较为敏感的急性期反应蛋白，在感染性疾病的筛查和诊断中有重要意义[13]，其检测结果的正确性和稳定性与患者的治疗密切相关，钩状效应可能导致相关疾病的误判从而延误患者的治疗[14]。同时SAA 具有快升快降的特点，容易导致钩状效应的发生，且临床检测工作中，由于待检样本很多，在不同患者中SAA 水平存在巨大差异，因此单从检测和诊断结果上通常难以发现错误的存在[15]。因此在研制SAA 检测试剂盒及临床检测过程中，必须注意并设法解决钩状效应。

在SAA 试剂盒的研制和使用过程中，发现测定值与定值之间的偏差过大的样本，如样本53、59、61 所测定的数据明显低于定值，同时对于SAA 超高值的检测，出现检测结果变小的现象。经鉴定，研制的SAA 试剂盒的线性范围广、测定结果精确度高、结果准确可靠，可以排除试剂盒性能因素的影响。进一步用研制的SAA 试剂盒测定超高值SAA定值血清，与其他公司的SAA 试剂测定结果比较，结果表明1 ～1000 mg/L 浓度范围的拟合曲线图中，在1 ～200 mg/L 的浓度范围内其定值和实测值基本一致，而超出200 mg/L 之后的测定值，实测值明显低于定值，但曲线未出现明显的下降趋势。在1 ～2000 mg/L、1 ～3000 mg/L 浓度范围的曲线图中，浓度范围超出500 mg/L 的测定数值与定值相差甚远，且整体曲线有明显的下降趋势，明显存在钩状效应。

尝试用稀释法解决钩状效应问题，即将测定结果中超出线性范围的样本视为超高值样本，对其进行梯度倍比稀释，每稀释一次都重新进行测定，直到稀释后的样本测定值在线性范围内（1 ～200 mg/L），最终测定值乘以稀释倍数，即为样本真实值，结果表明稀释法成功解决了钩状效应所带来的影响。