基于血清拉曼光谱技术对丙型肝炎病毒诊断和6a亚型的鉴别

陈 翀 黄杰庭

1.广州血液中心 广州市血液安全重点实验室质量控制部，广东广州 510095；2.广州血液中心 广州市血液安全重点实验室输血研究所，广东广州 510095

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染已成为全球性问题，约有1.7 亿感染者，其中中国感染者有一千多万[1-2]。HCV 感染早期病情隐匿，无典型症状，55%～85%未发现被感染而转变为慢性HCV，若不及时予以合理治疗，HCV 会加速肝纤维化，增加肝硬化的风险，一旦发展为肝硬化，则每年有1%～5%会发展至肝癌[3-5]。因此，HCV 早期筛查和分型，对预防HCV 传播和提高HCV 治疗效果有重要的临床意义[6]。本研究应用拉曼光谱（raman spectrum，RS）技术分析HCV 及健康人的血清，并评价其对HCV 诊断和6a 亚型鉴别的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究对象来源于广州血液中心，HCV 组共165 例，均为2018 年1 月至2019 年6 月在血液中心确诊HCV 感染患者，纳入标准：①符合HCV 的诊断标准[7]；②初筛血清HCV 抗体阳性；③血清RT-PCR 法完成HCV DNA 定量检测，其载量＞最低检测限（5×102），证实为HCV 感染。排除标准：①HBV、梅毒、HIV 等感染；②其他特殊全身性疾病；③近期急性感染；④免疫系统疾病；⑤标本不合格。另选择本中心同期无偿献血体检健康者120 例（所有检查项目未见异常者）为非HCV 组。本研究遵循《世界医学会赫尔辛基宣言》，入选对象均签署知情同意书。HCV 组年龄23 ～75 岁，平均（47.53±8.51）岁；男91 例，女74 例；基因分型：1b 87 例，3b 39 例，6a 19 例，其 他20 例。非HCV组年龄22 ～72 岁，平均（46.91±7.82）岁；男68 例，女52 例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集两组受试者空腹（禁食过夜8 h 以上）静脉血5 ml，室温静置0.5 h 后离心（3000 r/min）10 min，上层血清分装收集到EP 管中，-80℃冰箱保存待测。检测时将待测样本置于室温下静置0.5 h 让其充分溶解，吸取血清30 μl，静置15 min，待样本状态稳定后再进行检测，所有样本都统一进行上述预处理。

1.2.2 检测方法 使用DXR3 激光RS 仪（赛默飞公司），最低波数10 cm-1，光谱范围50 ～9000 cm-1，光谱分辨率≤0.35 cm-1，配备共焦显微镜，在50 倍镜下观察记录RS。每次检测开始前，在532 nm 激光下用质控品观察300 ～3000 cm-1位移范围内的RS 数据，仪器校准后再开始样本检测。参数设置：激光波长532 nm，光谱分辨率5 cm-1，拉曼位移范围300 ～3000 cm-1，扫描时间1.0 s。每份样本在不同位置分别检测3 次，所得图谱用Spectrum Analyzer 检测软件进行光谱记录分析。

1.3 观察指标

观察记录RS 诊断HCV 的结果和6a 亚型的鉴别结果。

1.4 统计学方法

采用Spectrum Analyzer 和Matlab 软件进行数据分析，应用自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（airPLS）扣除所得光谱图的荧光背景，应用偏最小二乘法（PLS）进行模型构建和支持向量机分类法（SVM）判别分析，计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，应用受试者工作特征（ROC）曲线评价airPLS-PLS-SVM 统计模型的诊断效果，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RS诊断HCV的结果

图1a、b、c 中虚线为HCV 组165 个样本的平均谱图，实线为非HCV 组120 个正常样本的平均谱图；图1a 使用airPLS 扣除所得光谱图的荧光背景后得到图1b，可见airPLS 扣除荧光背景前存在较大噪声干扰，这一操作是非常有必要的。进一步的数据分析比对得到图1c，可见在HCV 组与非HCV组300 ～3000 cm-1位移范围内的血清RS 图像形态相似，但部分位移处仍存在差异。

图1 HCV 组与非HCV 组拉曼数据的平均谱图

使用PLS 对扣除荧光背景后的数据进行降维、简化处理，提取9 个主成分，获得9 个（PLS-1 ～PLS-9）主成分绘制的散点图，见图2a、b、c，菱形为非HCV 组9 个主成分，圆形为HCV 组9 个主成分。由图2a、b、c 可见，HCV 组与非HCV9 个主成分在三维空间上存在部分重叠，但可区分开，这一点说明RS 技术能将HCV 患者血清与正常健康人血清区分开。

图2 HCV 组与非HCV 组PLS-1 ～PLS-9 散点图

应用SVM 对降维后的9 个主成分数据进行判别分析，采用简单随机抽样法将所有研究对象分组，大概按4 ∶3 的比例，其中训练集285 例（HCV 165 例，健康120 例），测试集122 例（HCV 70 例，健康52 例）。使用网格寻优法对SVM 中的参数惩罚因子（c）、核函数（g）进行寻优，所获结果见图3a，可见HCV 组与非HCV 组血清光谱数据被很好的区分开。应用ROC曲线评估airPLS-PLS-SVM 统计模型对测试集122 例血清的诊断效果，测试集中经RT-PCR 有70 例 确诊为HCV，非HCV 感染者52 例；本统计模型诊断正确阳性66 例，诊断正确阴性52 例，见表1，灵敏度为94.29%，特异度为96.15%，准确率为95.08%，ROC曲线见图3b，曲线下面积（AUC）为0.953。

表1 RSairPLS-PLS-SVM统计模型诊断HCV的结果

图3 3D 图及ROC 曲线图

2.2 6a亚型的鉴别分析

使用Matlab 软件对19 例6a 及146 例其他型HCV 患者的原始数据进行绘图，图4a 使用airPLS扣除所得光谱图的荧光背景后得到图4b，虚线为6a 亚型19 个样本的平均谱图，实线为146 个其他亚型样本的平均谱图，可见airPLS 扣除荧光背景前存在较大噪声干扰，这一操作是非常有必要的。进一步的数据分析比对得到图4c，可见在6a 亚型与其他亚型300 ～3000 cm-1位移范围内的血清RS图像形态相似，但部分位移处仍存在差异。

图4 6a 亚型和其他型HCVRS 的平均谱图

使用PLS 对扣除荧光背景后的数据进行降维、简化处理，提取6 个主成分，获得6 个（PLS-1 ～PLS-6）主成分绘制的散点图，见图5a、b，菱形为6a 亚型6 个主成分，圆形为其他亚型6 个主成分。由图5a、b 可见6a 亚型与其他型6 个主成分在三维空间上存在部分重叠，但可区分开，这一点说明RS 技术能将6a 亚型患者血清与其他型患者血清区分开。

应用SVM 对降维后的6 个主成分数据进行判别分析，采用简单随机抽样法将所有HCV 患者分组，其中训练集165 例（6a 19 例，其他146 例），测试集71 例（6a 9 例，其他62 例）。使用网格寻优法对SVM 中的参数惩罚因子（c）、核函数（g）进行寻优，所获等高线图见图5c，可见6a 亚型与其他型血清光谱数据被很好的区分开。应用ROC 曲线评估airPLS-PLS-SVM 统计模型对测试集71 例血清的诊断效果，本统计模型诊断正确阳性9 例，诊断正确阴性60 例，见表2，灵敏度为100%，特异度为96.77%，准确率为97.18%，AUC为0.976。

图5 6a 亚型与其他型PLS-1 ～PLS-6 散点图及等高线图

表2 RSairPLS-PLS-SVM统计模型诊断6a亚型的结果

3 讨论

RS 的光学原理为拉曼散射，是印度科学家在1928 年发现的，当一定频率的激光照射到样本表面时，一部分光被发生偏离，其波长较入射光长且短，运动方向、频率都发生变化，还有能量交换[8-9]。RS 技术具有快速、非侵入、非接触、高灵敏度、高分辨率、高特异性等独特优势，已广泛应用于生命科学、地质学、药学、考古学等领域[9-10]。血清RS 图谱一度被称为“指纹图谱”，通过RS 技术可发现患者因疾病而出现的蛋白质、核酸、脂类等的差异变化，凭借这一点血清RS 技术被用于临床疾病的鉴别诊断[11-13]。

图1 中虚线为HCV 组165 个样本的平均谱图，实线为非HCV 组120 个正常样本的平均谱图；图1a 使用airPLS 扣除所得光谱图的荧光背景后得到图1b，可见airPLS 扣除荧光背景前存在较大噪声干扰，这一操作是非常有必要的。进一步的数据分析比对得到图1c，可见在HCV 组与非HCV 组300 ～3000 cm-1位移范围内的血清RS 图像形态相似，但部分位移处仍存在差异。这些差异可能与HCV 感染后导致的机体代谢或免疫变化有关，如血清中某些物质的成分、含量或结构发生改变，与健康人相比，HCV 患者血清中胶原蛋白、核酸、磷脂含量可能增加，儿糖类、氨基酸含量可能下降[14-15]。图2 可见HCV 组与非HCV 9 个主成分在三维空间上存在部分重叠，但可区分开，这一点说明RS 技术能将HCV 患者血清与正常健康人血清区分开。图3a 可见HCV 组与非HCV 组血清光谱数据被很好的区分开，RS 诊断HCV 的灵敏度为94.29%，特异度为96.15%，准确率为95.08%，AUC 为0.953；表明文中所用统计方法较可靠。

图4a 使用airPLS 扣除所得光谱图的荧光背景后得到图4b，虚线为6a 亚型19 个样本的平均谱图，实线为146 个其他亚型样本的平均谱图，可见airPLS 扣除荧光背景前存在较大噪声干扰，这一操作是非常有必要的。进一步的数据分析比对得到图4c，可见在6a 亚型与其他亚型300 ～3000 cm-1位移范围内的血清RS 图像形态相似，但部分位移处仍存在差异。由图5a、b 可见6a 亚型与其他型6 个主成分在三维空间上存在部分重叠，但可区分开，这一点说明RS 技术能将6a 亚型患者血清与其他型患者血清区分开。图5c 可见6a 亚型与其他型血清光谱数据被很好的区分开。应用ROC曲线评估airPLS-PLS-SVM 统计模型对测试集71 例血清的诊断效果，本统计模型诊断正确阳性9 例，诊断正确阴性60 例，灵敏度为100%，特异度为96.77%，准确率为97.18%，AUC为0.976；说明RS 在6a 亚型鉴别中有较强的应用潜力。

综上所述，血清RS 可用于HCV 诊断和6a 亚型的鉴别，有望成为HCV 快速筛查及分型工具，但国内相关报道并不多，本研究为RS 在HCV 诊断和6a 亚型鉴别的应用奠定良好基础。但本研究样本量较少，数据结果可能存在部分偏倚，仍需大样本进一步证实。