HPLC法测定正骨水中丹皮酚含量的不确定度分析

陈恒冲 马彬峡 孙晓宁

1.辽宁省本溪市药品检验所，辽宁本溪 117000；2.辽宁省本溪市卫生学校，辽宁本溪 117000

测量不确定度是利用可获得的信息，表征合理地赋予被测量量值分散性的非负参数[1]。通过评估不确定度，使检验结果由单一数值变为可能分布的数值范围[2]，可有效提高检验结论的准确性和科学性[3-6]，尤其在检测结果为边缘值时，对结果符合性的判定起到重要作用。《中国药品检验标准操作规范》2015 年版介绍了pH 值测定法、非水溶液滴定法等检验方法不确定度评定的实例[7]，说明测量结果不确定度评定与表示将在我国药品检验领域全面应用，对我国药品检验标准及检测数据与国际接轨起到积极的推动作用[8-14]。

本研究根据《测量不确定度评定与表示 》[1]和《化学分析中不确定度的评估指南》[15]中的有关规定，利用在实验室资质认定过程中对检测方法确认研究的数据，对《中华人民共和国药典》2015 年版一部正骨水含量测定的检测结果不确定度进行评定分析[16]，并讨论采用方法确认数据进行不确定度评定的优势。

1 测定方法及不确定度来源分析

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪（日本岛津，2010AHT 型）；电子天平（德国 Sartorius，BT25S 型）；正骨水（广西玉林制药集团有限责任公司，批号：1811362）；丹皮酚对照品（中国食品药品检定研究院，含量：99.8%，批号：110708-201407）；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为一级纯化水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Aglilent zorbax C18（150 mm×5 mm）；流动相：乙腈-水-三乙胺-磷酸 （28∶72∶0.1∶0.1）；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：对照品溶液与供试品溶液各10 μl。

1.3 测量流程及结果计算模型

HPLC 法测定正骨水中丹皮酚含量的测量流程见图 1。

图1 丹皮酚含量测定流程图

根据分析过程，丹皮酚的含量可用下面公式计算：

C χ为供试品中丹皮酚的含量（mg/ml）；Aχ为供试品溶液的峰面积；Ar为对照品溶液的峰面积；mr为对照品的称样量（mg）；P为对照品的纯度，以质量分数的形式给出（%）；Dr为对照品溶液的稀释倍数；Dχ为供试品溶液的稀释倍数。

1.4 不确定度来源分析

从检测过程和数学模型分析对HPLC 法测定正骨水中丹皮酚含量的测定结果有影响的因素，确定可能产生不确定度的所有来源，包括对照品称量误差和重复性，对照品溶液稀释过程，供试品溶液稀释过程，HPLC 进样和峰面积积分的重复性等。HPLC法测定正骨水中丹皮酚含量的测量不确定度因果关系见图2。

图2 HPLC 法测定正骨水中丹皮酚含量的测量不确定度来源

因为方法确认试验中重复性和回收率的研究考虑了不同体积测量装置校准的影响[15]，如果采用方法确认数据来评估测量不确定度，可将上述因果关系图重新调整成图3。重复性试验测定了6 份平行配制的供试品溶液，对其不确定度分析可以涵盖供试品溶液配制和测定的重复性不确定度，但却不能涵盖对照品溶液配制的不确定度，所以本例量取对照品溶液（1）另外配制6 份对照品溶液进行测定。通过回收率的测定及不确定度分析，可涵盖由玻璃量器校准、进样器容量误差、温度以及其他诸多因素带来的不确定度。未被重复性及回收率的不确定度分析涵盖的来源，如本研究中的对照品称量、对照品纯度，仍应分别予以考察。

图3 HPLC法测定正骨水中丹皮酚含量的测量不确定度来源调整图

2 测量不确定度评定

2.1 不确定度分量的量化

2.1.1 重复性（I，A 类评定）

2.1.1.1 供试品溶液重复性（Ix） 依法配制6 份供试品溶液分别测定峰面积，试验数据见表1。供试品溶液重复性的相对标准不确定度：

2.1.1.2 对照品溶液重复性（Ir） 精密量取对照品溶液（1）2 ml，依法稀释，平行配制6 份对照品溶液分别测定峰面积，试验数据见表1。对照品溶液重复性的相对标准不确定度：

合成重复性相对标准不确定度：

2.1.2 回收率（Rec，A 类评定） 精密量取供试品溶液5 ml，对照品溶液（1）3.5 ml，置于同一25 ml量瓶中，稀释至刻度。平行配制6 份依法测定，试验数据见表1。回收率的相对标准不确定度 ：

2.1.3 对照品纯度 丹皮酚对照品由中国食品药品检定研究院提供，纯度以99.8%计，但未提供其不确定度的信息，故本文不予评定。

表1 重复性及回收率试验数据

2.1.4 对照品称量（mr）

2.1.4.1 天平校准的不确定度（B 类评定） 所用电子天平（d=0.01 mg），依据计量检定结果，最大示值误差为±0.04 mg，按矩形分布计算，取包含因子，则标准不确定度为：

2.1.4.2 称量重复性的不确定度（B 类评定） 依据计量检定结果，重复性误差为±0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，则标准不确定度为：

2.1.4.3 分辨率的不确定度（B 类评定） 天平的可读性为0.01 mg，按矩形分布，取包含因子 k =，则标准不确定度为：

合成以上天平称量不确定度来源，单次称量的标准不确定度为：

因采用减量称量，2 次读数独立不相关，对照品取样量为15.02 mg，则其引入的相对标准不确定度为：

2.2 合成标准不确定度

合成相对标准不确定度：

实验中测得丹皮酚含量为0.22 mg/ml，则合成标准不确定度：

2.3 扩展不确定度与报告

实验结果一般用扩展不确定度表示，取包含因子 k=2（置信概率约95%），则含量测定结果的扩展不确定度为：

正骨水中丹皮酚的1 次含量测定结果可表示为（0.22±0.0018）mg/ml（k=2）。

2.4 各不确定度分量对比

对比各不确定度分量可以看出，回收率对不确定度的影响最大，其次为对照品称量。见图4。

图4 测量不确定度的比较

3 讨论

通过扩展不确定度与报告的结果可以看出，本实验室依法测定正骨水中丹皮酚含量的不确定度较小，仅为测定结果的±0.8%，说明该测定方法稳定、准确，本实验室出具的测定结果可信度较高。对比各不确定度分量可以看出，回收率对不确定度的影响最大，其次为对照品称量。检测过程中应重点关注回收率各影响因素的控制，保证高效液相色谱仪、玻璃量器均在稳定可控的范围内使用，对照品溶液与供试品溶液在温度稳定的环境中同时配制。同时，检测人员应根据天平的精度和量程范围选择适宜的天平，并注意在称量过程中规范操作。

在药品检测过程中，通常使用的将计算公式作为测量模型划分不确定度分量的方式，本例利用重复性、回收率等方法确认研究数据进行不确定度评定，可同时覆盖不同测定环节的检测结果影响因素，简化不确定度评定步骤，又可以包含供试品制备过程、基质干扰等无法量化和尚未考虑到的影响因素。但不同的检测品种及项目，测定过程会有区别，应结合实际，全面考虑不确定度来源，合理设计方法确认试验。

本研究仅采用了1 次方法确认的研究数据进行不确定度评定，样本数量相对较少。如结合不同时间、不同分析人员的重复性试验，即中间精密度的数据，以及多次回收率试验的数据，可以不断修正不确定度分量，更合理的评定不确定度。