UPLC 法测定不同产地五指毛桃中芹菜素等6 个黄酮含量

黄建梅，蔡庆群，丘振文

广州中医药大学第一附属医院 药学部，广州 510405

五指毛桃为桑科榕属（Ficus）植物粗叶榕（Ficus hirta）的干燥根[1]。因其掌状叶形似五指，果实状如毛桃而称为五指毛桃，是具有岭南地域特色的一味中草药[2]。其主产地为我国云南、贵州、广西、广东以及东南亚地区等。味甘性平，有健脾补肺、行气活络、利湿舒筋之功[3，4]。除药用外，五指毛桃常被岭南人民用来煲汤、入药膳，具有悠久的应用史[5]。

五指毛桃作为药食两用的中药材，近年来有关其化学成分的研究逐渐受到重视，目前分离得到的有效成分主要是香豆素类和黄酮类化合物[6，7]。伍世恒等[8]建立了五指毛桃中香豆素类成分的超高效液相色谱法（UPLC）含量测定方法，该方法测定时间短，快速提高了效率。目前关于黄酮类成分的研究多采用HPLC 法测定含量[9]。本研究采用UPLC 法建立五指毛桃中6 个主要黄酮类成分（芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荆苷、山奈酚、紫云英苷）的含量测定，并对不同产地五指毛桃中的这些黄酮成分进行分析，以期为五指毛桃药材的质量稳定性提供依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 药材与试剂

五指毛桃（GD_1，批号/采样日期20190309，广东河源；GD_2，批号/采样日期20190310，广东从化；GD_3，批号/采样日期20190311，广东翁源；GD_4，批号/采样日期20190312，广东广州；GX_1，批号/采样日期20190502、GX_2，批号/采样日期20190503，产地均为广西桂林；GX_3，批号/采样日期20190612、GX_4，批号/采样日期20190614，产地均为广西玉林；YN_1～YN_4，批号/采样日期分别为20190715、20190716、20190717、20190718，产 地 均为云南昆明；GZ_1～GZ_4，批号/采样日期分别为20190912、20100914、20190915、20190920，产 地 均为贵州遵义。经广州中医药大学第一附属医院丘振文主任药师鉴定确认为五指毛桃。

对照品：芹菜素（批号：A20857，纯度98%）、橙皮苷（批号：A10047，纯度98%）、木犀草素（批号：B20047，纯度98%）、牡荆苷（批号：B20213，纯度98%）、山奈酚（批号：Z00847，纯度98%）、紫云英苷（批号：B12013，纯度98%），均购于广州市勤科生物公司。

1.2 仪器

Acquity UPLC 系统（QSM 四元溶剂管理系统、Empower 3 色谱工作站），美国Waters 公司；CP225D 电子天平（德国）；DV215CD 型十万分之一电子分析天平（美国）；KQ300 超声波清洗器（广州市超声波设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

五指毛桃根充分干燥后粉碎，精密称取过三号筛的粉末0.3 g，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇溶液40 mL，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，用甲醇补至50 mL，混匀，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荆苷、山奈酚、紫云英苷适量，加甲醇制成每毫升含上述6 个黄酮成分0.1 mg 的对照品储备溶液。精密量取各对照品储备溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL于10 mL 量瓶中，加入甲醇至刻度处，混匀，即得系列混合对照品溶液。

2.3 HPLC 法色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7 μm）；流动相A 为甲醇-乙腈（1∶1）溶液，B 为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～4 min 20%～60%B，4～5 min 60%B，5～9 min 60%～80%B，9～10 min 80%B；柱温：30 ℃；检测波长：365 nm；流速：0.5 mL·min-1；进样体积：10 μL。

在上述“2.3”项下UPLC 法色谱条件下，理论塔板数和分离度均能达到要求（见表1）。由图1 所示，在此色谱条件下，各成分分离较好，专属性强，且分析时间短，仅需10 min，快速地提高了分析效率。

表1 不同条件的系统适用性参数

图1 五指毛桃黄酮成分UPLC 色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密吸取“2.2”项下各对照品溶液10 μL，按“2.3”项下UPLC 色谱条件进样对峰面积进行测定，以测定的峰面积值为纵坐标（Y），各对照品进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线。如表2 所示，6 个黄酮类成分在相应的线性范围内呈现出良好的线性关系。

表2 6 个黄酮类成分的回归方程、线性范围

2.4.2 精密度试验精密吸取各对照品溶液10 μL，按“2.3”项下UPLC 色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积值，计算峰面积RSD 值均＜2%。见表3。

表3 精密度、稳定性、重复性及加样回收率试验结果（n=6）

2.4.3 稳定性试验精密吸取“2.1”项下各供试品溶液10 μL，按“2.3”项下UPLC 色谱条件测定，每隔2 h 测定1 次并记录峰面积，测定24 h 内供试品溶液的稳定性，其RSD 值＜2%。见表3。

2.4.4 重复性试验称取五指毛桃样品0.3 g，共6份，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下UPLC 色谱条件测定，记录峰面积，将峰面积代入相应对照品的标准曲线公式中，计算进样量，然后根据稀释倍数和称样量计算出各黄酮成分含量及其RSD 值。样品重复性的RSD＜2%。见表3。

2.4.5 加样回收率试验精密称定已知含量的供试品0.3 g，分别加入适量的芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荆苷、山奈酚、紫云英苷的对照品，使对照品加入量与所取供试品中的待测定成分质量之比在1∶1 左右，平行操作6 次，按照“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下UPLC 色谱条件进样测定，记录峰面积，将峰面积代入相应对照品的标准曲线公式中，计算出进样量，然后根据稀释倍数和称样量计算出各黄酮成分含量及其平均加样回收率在98.53%～100.15%。见表3。

2.5 不同产地五指毛桃黄酮含量测定

称取不同产地的五指毛桃样品0.3 g，按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下UPLC 色谱条件进样测定，记录峰面积，将峰面积代入相应对照品的标准曲线公式中，计算各黄酮成分含量。采用TB tools 热图绘制选项以及PCA 绘制功能对各产地五指毛桃样品进行聚类分析。不同产地五指毛桃样品中的6 个黄酮类成分含量存在明显的差异，芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荆苷、山奈酚、紫云英苷含量范围分别是23.02～40.89、9.45～22.45、4.25～10.38、4.28～10.02、4.98～10.68、1.55～5.12 mg·g-1。由测定结果表明，广东产五指毛桃6 个黄酮类成分含量最高，而贵州产地的最低。见表4。

表4 16 批样品含量测定结果（mg·g-1，n=3）

聚类分析结果较好地体现了不同产地间黄酮含量的差异性，这为五指毛桃营养价值、药用开发提供了理论导向。

3 讨论

3.1 提取方法的考察

本研究前期采用不同溶媒对样品进行提取，发现甲醇的提取效果最好。选择了以工艺更加简便的超声提取法，以功率250 W、频率40 kHz、时间30 min为提取效率最高。

3.2 不同比例流动相的考察

本研究系统地考察了0.1%乙酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈以及所确定的流动相等多种流动相系统。最终选用的流动相虽然较为复杂，但却能有效地分离五指毛桃中6 个黄酮且保留时间适中。适合样品中不同黄酮成分的分离。

3.3 柱温的考察

本研究系统考察了不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃）对分离效果的影响，结果表明，当温度为30 ℃时分离效果最好，而其它温度下至少会有一个峰的分离度达不到要求，故选用30 ℃作为色谱柱温度。

4 小 结

本研究首次建立了五指毛桃中6 个黄酮成分的UPLC 含量测定方法。该方法操作简便，重复性高，稳定性好和专属性强，并且分析时间短，迅速地提高了分析效率，可作为五指毛桃黄酮类成分的含量测定方法。

对不同产地五指毛桃中6 个黄酮成分的比较分析，结果表明，不同产地6 个黄酮类成分具有显著差异，以广东产的五指毛桃中黄酮含量最高，且具有明显的产地聚类特性。这对提高五指毛桃质量标准及其优质来源提供了参考依据。