响应面优化百香果果皮黄酮提取工艺

任美燕

山西工商学院 (太原 030006)

百香果俗称“巴西果”和“鸡蛋果”，其营养价值丰富，其用途主要生产果汁，可发酵果酒，对果皮的利用率低[1-2]。目前对百香果果皮的研究集中在制成果皮粉及果胶、色素、多糖、多酚等活性物质的提取利用[3-6]。研究结果发现其黄酮含量丰富，其活性成分具有控制血糖、抗氧化、降血脂等作用[7-8]。百香果果皮中的黄酮作为保健品，具有丰富的营养价值以及广泛的应用前景[9]。

通过比较不同的提取方法发现，其中以超声提取总黄酮的提取率更高，该方法使原料与提取剂之间始终保持较大的有效成分浓度差，减少了滤渣中溶质残留，有效提高提取过程的效率[10-14]。因此本文采用超声提取百香果果皮中黄酮，并且以黄酮得率为指标，采用响应面法，确定最佳提取工艺条件，为百香果果皮黄酮的纯化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫百香果，广西省玉林市；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、芦丁标准品，分析纯，北京华威锐科化工有限公司。

1.2 仪器与设备

F80型高速粉碎机，上海标本模型厂；恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；755B型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16GB型离心机，金坛市大地自动化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1原料处理

百香果外表完好无破损，去瓤取果皮。切块放入恒温干燥箱80 ℃烘干至恒重，用粉碎机碾压成粉末，60目过筛，密封收于冰箱冷藏保存。

1.3.2芦丁的标准曲线绘制[15]

配制0.1 mg/mL 的芦丁标准液，取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 至 10 mL 具塞比色管中，用50%乙醇定容至5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，加入4%的NaOH溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容至10 mL，摇匀后静置15 min后，在510 nm处测定吸光度，以吸光度Y对芦丁浓度X(mg/mL)进行线性回归：

y=0.113 1x-0.000 8，R2=0.999 5

1.3.3单因素实验

1.3.3.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

称取1 g百香果果皮粉末，设定料液比(g/mL)为1∶20、提取温度50 ℃、提取时间30 min、提取功率250 W，设定乙醇浓度20%、40%、60%、80%、100%进行超声提取，测定黄酮得率。

1.3.3.2 提取温度对黄酮得率的影响

称取1 g百香果果皮粉末，设定料液比(g/mL)1∶20、乙醇浓度60%、提取时间30 min 、提取功率250 w，提取温度设定30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃进行超声提取，测定黄酮提取率。

1.3.3.3 料液比对黄酮得率的影响

称取1 g百香果果皮粉末，设定乙醇浓度60%、提取时间30 min、提取温度50 ℃、提取功率250 W、料液比(g/mL)设定1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70进行超声提取，测定黄酮得率。

1.3.3.4 提取时间对黄酮得率的影响

称取1 g百香果果皮粉末，设定乙醇浓度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取温度50 ℃、提取功率250 W、提取时间设定10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行超声提取，测定黄酮得率。

1.3.3.5 超声功率对黄酮得率的影响

称取1 g百香果果皮粉末，设定乙醇浓度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取温度50 ℃、提取时间30 min，提取功率设定200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W进行超声提取，测定黄酮得率。

1.3.4响应面实验设计

根据单因素实验结果，对提取黄酮实验中乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)3个因素3个水平，运用Design-Expert8实验设计软件，完成三因素三水平响应面试验设计。实验因素编码及水平如表1。

表1 响应面分析因素与水平

1.4 黄酮得率的计算

黄酮含量的测定[20]：分别吸取不同工艺参数的提取液1 mL，依次加入4 mL 60%的乙醇，分别加入0.3 mL 5%的NaNO2，摇匀，静置6 min；再依次加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3，摇匀，静置6 min，再分别加入 4 mL 1 mol/L的NaOH，用60%乙醇定容至50mL，摇匀，静置20 min，然后于510 nm测吸光度，计算黄酮得率：

黄酮得率(mg/g)=(0.113 1A-0.000 8)×v/m

式中：A为黄酮的吸光度；v为黄酮提取液总体积，mL；w为百香果果皮干粉质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1乙醇浓度对黄酮得率的影响

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

如图1所示，黄酮得率随着乙醇浓度的增加而增加，但乙醇浓度超过60%后提取率开始下降，这是因为一些醇溶性杂质、色素、亲脂性成分的溶出量增大，故乙醇的最适提取浓度为60%。

2.1.2提取温度对黄酮得率的影响

图2 提取温度对黄酮得率的影响

如图2所示，百香果皮当中的黄酮得率随着提取温度的升高而发生变化，并且在提取温度为50 ℃的时候，提取率最高，之后黄酮得率下降。这是因为随着温度升高，乙醇挥发，百香果果皮中果胶等一些物质的溶出量也会相应增加，不利于黄酮的提取。因此50 ℃是提取百香果果皮当中黄酮的最适提取温度。

2.1.3料液比对黄酮得率的影响

如图3所示，黄酮得率随着料液比的增加而增大，当料液比(g/mL)达到1∶50时黄酮得率最高，之后料液比再增大，黄酮得率呈下降趋势。这是因为随着提取溶剂用量的增加，使百香果果皮当中，黄酮物质提取率的浓度差大大增加，从而提高了传质速度，使百香果果皮当中黄酮提取率上升。当溶剂增加到一定程度后，黄酮已经被大部分提取出来，此时料液比对黄酮得率的影响降低。百香果果皮中的黄酮提取的最适料液比(g/mL)为1∶50。

图3 料液比对黄酮得率的影响

2.1.4提取时间对黄酮得率的影响

图4 提取时间对黄酮得率的影响

如图4所示，百香果皮当中黄酮得率随着时间的增加而大幅度上升。但当提取时间为40 min时，黄酮得率最高，之后得率有所下降。因此，选用40 min是黄酮的最适提取时间。

2.1.5超声功率对黄酮得率的影响

图5 超声功率对黄酮得率的影响

如图5所示，在超声功率较小时，黄酮得率随着超声功率的增加而响应地提高，当超声功率为250 W时，达到黄酮得率的最高值。随着超声功率的不断增大，百香果果皮中的其他物质被提出，影响黄酮的溶出。因此，超声功率250 W是最适提取条件。

2.2 响应面法实验结果

2.2.1响应面法实验方案及结果分析

根据单因素的实验结果，固定料液比(g/mL)在1∶50、超声功率250 W，考察乙醇浓度、提取时间、提取温度3个因素对百香果果皮黄酮提取率的影响，用响应面法进行优化，以百香果黄酮得率作为响应值。根据响应面法中Box-Behnken实验原理运用Design-Expert 8进行设计，实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验因素水平设计与结果

利用Design-Expert8软件对表2中实验数据进行二次多项逐步回归拟合，得回归模型方程为：Y=19.18+0.1125A+0.3375B+0.45C-0.725AB-0.7AC-0.6BC-2.2775A2-0.3275B2-1.2025C2

2.2.2模型的显著性检验

对确定回归模型进行显著性检验，结果见表3。结果表明，P<0.05，对百香果果皮黄酮提取建立的二次多项模型具有显著性，失拟项不显著。该模型拟合度较好，实验误差小，能够用来分析和与预测百香果果皮中总黄酮的提取。其中一次项B项、C项显著，A项不显著。交互项AC、AB、BC显著，二次项B2不显著，A2、C2项显著。根据表3中F值的大小判断各因素的影响程度次序为提取温度>提取时间>乙醇浓度，其中提取温度和提取时间对百香果果皮的黄酮提取率的影响达到显著水平。乙醇浓度、提取时间、提取温度的之间的相互作用见图6～图8。

通过模型预测百香果果皮黄酮提取的最适条件是：乙醇浓度59.30%、提取时间42.62 min、提取温度50.38 ℃，黄酮得率理论值为19.281 6 mg/g。为检验响应曲面法预测结果的可靠性，采用优化的提取条件进行百香果果皮提取，考虑实际操作的方便性，将提取工艺参数修正为乙醇浓度60%、提取时间40 min、提取温度50 ℃，测得黄酮得率为19.212 4 mg/g，与理论预测基本吻合，说明基于响应面法优化的提取工艺参数准确可靠，有实用价值。

表3 二次响应面回归模型方差分析表

图6 乙醇浓度和提取时间对黄酮得率的影响

图7 乙醇浓度和提取温度对黄酮得率的影响

图8 提取时间和提取温度对黄酮得率的影响

3 结论

本试验以黄酮的提取率为考查指标，采用超声提取法使百香果果皮与提取剂之间始终保持较大的有效成分浓度差，减少了滤渣中溶质残留，可有效提高提取过程的效率。通过响应面法优化百香果果皮中黄酮的提取工艺，结果表明最佳工艺条件为：乙醇浓度60%、提取时间40 min、提取温度50 ℃，测得黄酮得率为19.212 4 mg/g。重复性试验和验证试验结果表明，超声波提取工艺重复性好、工艺方案稳定可行。