基于网络药理学的康艾注射液抗非小细胞肺癌作用机制分析

林 玲，吴勤研，宋熙薇

中国人民解放军东部战区总医院 药剂科，南京 210002

肺癌是临床上常见的恶性肿瘤，发病率、致死率居于首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%，大部分的NSCLC 患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳手术时期，因而化疗成为其治疗的主要手段之一[1-3]。近年来，相关文献报道[4，5]化疗药物与中药制剂联合使用，具有不良反应低、治疗效果好的特点，如康艾注射液。康艾注射液由黄芪、人参和苦参素制成，具有益气扶正、增强机体免疫、减轻化疗毒副反应、提高化疗效果的作用[5]，用于治疗原发性肝癌、肺癌、直肠癌和恶性淋巴癌等。以往研究者对康艾注射液的研究集中在单味药物的药效成分、药理作用及化疗药物联合使用的临床研究上。然而康艾注射液中涉及成分较多，可能通过多靶点、多途径发挥药理作用，其相关作用机制研究仍不明确。网络药理学是以系统生物学为基础，从整体角度探索“药物-靶点-疾病”复杂网络关系，广泛运用于中药复杂的作用机制研究[6，7]。本研究借助网络药理学的技术与方法，对康艾注射液多成分、多靶点间复杂网络关系进行较全面系统地分析，为进一步深入研究其药理作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据库

中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；通用蛋白质数据库UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）；人类基因数据库Genecards（http://www.genecards.org/）；蛋白质互作平台STRING10.5（http://www.string-db.org/）；生物学信息注释数据库DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp）。

1.2 康艾注射液中主要化学成分的收集与筛选

在TCMSP 数据库的“search”一栏中，分别输入黄芪、人参和苦参，收集相关的化学成分；设置阈值标准[7]（口服利用度OB＞30%、类药性DL＞0.18），对上述化学成分进行筛选。

1.3 药物作用靶点的筛选

在TCMSP 数据库的“target”一栏中，分别输入化合物编号（如：MOL000392），得到该化合物的对映靶点；将靶点导入通用蛋白质数据库UniProt，选择“Human genes”，得到人的靶点基因；在人类基因数据库Genecards 输入“NSCLC”，得到非小细胞肺癌全部基因，与上述靶点基因进行映射，得到康艾注射液作用于非小细胞肺癌的靶点基因。

1.4 康艾注射液的化合物-靶点网络的构建

将化合物与其对映的靶点基因在Excel 表中列出，化合物名称设置为“#node1”，靶点基因栏设置为“node2”。将Excel 表导入Cytoscape 3.7.0 软件，得到化合物-靶点网络结构关系图；用Cytoscape 3.7.0软件中“Network analyzer”功能，对网络拓扑属性进行分析，得到康艾注射液抗非小细胞肺癌的主要活性成分。

1.5 康艾注射液蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将上述1.3 得到的靶点基因上传到STRING 10.5 软件（http://www.string-db.org/），设置物种为“Homo sapiens”，进行检索，得到PPI 网络结构图；用STRING 10.5 软件对PPI 网络图进行分析，得到相关靶点参数。

1.6 康艾注射液相关靶点基因本体GO 富集分析和京都基因百科全书（KEGG）生物通路富集分析

将PPI 网络中的蛋白质靶点导入生物学信息注释数据库DAVID6.8（http://david-d.ncifcrf.gov/tools.jsp），对PPI 网络中涉及蛋白靶点进行GO 功能和KEGG 通路生物富集分析。

2 结果

2.1 康艾注射液中活性化合物的筛选

在TCMSP 数据库里，检索黄芪，共得到87 个化合物，筛选出8 个符合条件化合物；检索人参，共得到190 个化合物，筛选出8 个符合条件化合物；检索苦参，共得到113 个化合物，筛选出5 个化合物。上述筛选阈值[7]分别是OB＞30%、DL＞0.18。OB值代表口服利用度，药物经过口服途径给药后吸收进入血液循环的相对量；DL 代表类药性，化合物与已知药物的相似性，用于发掘高质量的先导化合物。结合相关文献[8]引入槐醇（sophranol）和槐胺（sophoramine）两个化合物。康艾注射液中含有的23个活性化合物基本信息。见表1。

2.2 康艾注射液化合物-靶点相互作用网络

利用23 个化合物与其对映的靶点的关系，构建化合物-靶点网络，见图1。在化合物-靶点网络中，总共包括123 个节点（23 个化合物节点和100个靶点节点）和383 条边。对网络拓扑属性进行分析，得出相应的节点度值（degree）和介数参数（betweenness centrality）。度值表示网络中与节点连接的路线条数，度值越大，表示该节点在整个网络中起到重要枢纽作用，可能是主要活性成分或靶点；介数则表示该节点在网络中所有最短路径中经过该节点的路径条数与最近路径总数比。度值和介数是量化某个节点在拓扑网络中的重要性[6，7，9，10]。

表1 康艾注射液中含有23 个活性化合物基本信息

图1 康艾注射液化合物-靶点网络

表2 列出了化合物-靶点网络中化合物和靶点的度值和介数（筛选设置Degree＞4[6]）。

从表2 中看出，在康艾注射液多成分中，起主要作用的化合物有MOL000422（山奈酚），MOL000354（异鼠李素），MOL000358（β-谷甾醇），MOL000449（豆甾醇），MOL006634（氧化苦参碱）和MOL005944（苦参碱）等；作用靶点有PTGS2、PTGS1、SCN5A、PRKACA 和HSP90A 等。

表2 康艾注射液化合物-靶点网络关键节点及其拓扑学性质

2.3 康艾注射液靶点PPI 网络的构建与分析

蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）是反映蛋白之间相互作用关系的网络，能分析出一系列生物分子相互作用有关的重要靶蛋白。为了更好地理解康艾注射液对非小细胞肺癌的作用机制，基于PPI 关系，采用STRING 10.5 软件构建康艾注射液靶点的PPI 网络。分析PPI 网络，得到93 个蛋白质节点（其中有7 个节点未显示），597 条相互作用的边（PPI enrichment p-value：＜1.0×10-16）。

为了提供更精确的结果，用STRING 10.5 软件分析该网络（见上述材料方法1.5），得到主要相关靶点（涉及蛋白IL6、TNF、JUN、MYC、CASP3、MAPK8、PTGS2 等），用Origin8.0 软件作图，见图2。

将上述蛋白靶点导入STRING 10.5 软件，得到筛选后的蛋白互作网络，见图3。

图2 PPI 网络中的重要靶点（筛选后）

图3 康艾注射液相关靶点的PPI 网络（筛选后）

2.4 康艾注射液GO 富集与KEGG 通路富集分析

采用DAVID6.8 平台上的GO 和PATHWAY 富集分析功能，对康艾注射液PPI 网络中涉及93 个蛋白质功能进行分析。对GO 进行富集分析，得到43个条目[设置错误发生率（FDR＜0.01）作为筛选条件，见表3]，其中生物过程相关的条目有32 个，涉及氧化反应、细胞对化学刺激反应、对有毒物质反应、内源刺激反应、细胞信号传导、激素应答和细胞增殖的调控等方面；分子功能相关的条目6 个，涉及蛋白结合、酶结合位点、乙酰胆碱受体诱导活性和G蛋白偶联胺受体活性等方面；细胞组成相关的条目5 个，涉及膜筏、质膜区域和投射神经元等方面。

对KEGG 通路富集分析中，得到50 个信号通路，根据FDR 筛选出5 条通路（见表4），分别为癌症通路、白介素-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、雌激素受体信号传导通路和NF-kappa B 信号通路，推测康艾注射液的有效成分可以作用于这些通路来达到抗NSCLC 的作用。在本研究中，癌症通路上有27 个基因富集，分别为BAX、BCL2、CASP3、ESR1、ESR2、GSK3B、GSTM1、GSTM2、GSTP1、HMOX1、HSP90AA1、IFNG、IL6、JUN、MAPK8、MMP1、MMP2、MYC、NCOA1、NFKBIA、NOS2、PIM1、PPARG、PRKACA、PTGS2、RELA、RXRA；有14 个基因富集在白介素-17 通路上，分别为CASP3、GSK3B、HSP90AA1、IFNG、IL1B、IL6、JUN、MAPK14、MAPK8、MMP1、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF；有13 个基因富集在肿瘤坏死因子通路上，分别为CASP3、ICAM1、IL1B、IL6、JUN、MAP2K4、MAPK14、MAPK8、NFKBIA、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1；有11 个基因富集在雌激素受体通路上，分别为BCL2、ESR1、ESR2、HSP90AA1、JUN、MMP2、NCOA1、NCOA2、OPRM1、PGR、PRKACA；有9 个基因富集在NF-kappa B 信号通路上，分别是BCL2、ICAM1、IL1B、NFK BIA、PLAU、PTGS2、RELA、TNF、VCAM1。

表3 康艾注射液PPI 网络中的GO 条目（FDR＜0.01）

表4 康艾注射液PPI 网络中的通路（FDR＜0.01）

3 讨论

网络药理学是基于系统生物学的理论，对复杂生物系统的网络分析，择取特定信号节点（Nodes）进行多靶点药物分子设计的新兴学科；根据其具有整体性和系统性的特点，用于挖掘复方中药制剂的药效成分、作用靶点及预测适应症[6]。康艾注射液是经由人参、黄芪和苦参素3 味中药制备而成的一种抗癌药，临床上与化疗药物（如顺铂）联合治疗非小细胞肺癌效果显著[11]。本研究依托TCMSP 中药系统药理学分析平台研究了康艾注射液中3 味中药的有效成分，同时构建了化合物-靶点网络和蛋白互作PPI 网络，利用DAVID6.8 平台对PPI 网络中涉及的蛋白质进行GO 富集和KEGG 信号通路富集。

化合物-靶点网络中涉及的关键的化合物有山奈酚、β-谷甾醇、氧化苦参碱和苦参碱等。山奈酚是广泛存在于中药材、水果和蔬菜中的黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗动脉粥样硬化，保护神经系统和防治糖尿病等药理作用[12]。山奈酚具有良好的抗癌生物活性，对白血病、肺癌[13]、结肠癌[14]和肝癌[15]等多种癌症有显著疗效。β-谷甾醇是植物甾醇的一类，存在于蔬菜、茶叶、中药材和水果中，具有抑制肿瘤生长、防治前列腺增生、抑制乳腺增生和免疫调控等生物活性[16]。周玲玉等[17]研究β-谷甾醇对人肺癌A549 细胞增殖及凋亡的影响，发现β-谷甾醇通过抑制肺癌A549 细胞周期中的G2/M 期，促使癌细胞凋亡，达到抗肿瘤的目的。氧化苦参碱通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞分化、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞黏度与浸润转移和抑制端粒细胞的活性等过程达到抗癌、防癌的作用[18]。上述筛选的化合物中，现有文献报道较多的是氧化苦参碱[18]与康艾注射液临床研究一致，而山奈酚、β-谷甾醇、异鼠李素和芒柄花素等研究较少，随着研究不断深入，越来越多的抗癌活性成分被逐渐挖掘出来。

化合物-靶点网络中涉及重要靶点有PTGS2、PRKACA、HSP90A 等。PTGS2 又称环氧化酶-2，是PEG2 合成的重要限速酶，在炎症或肿瘤形成过程中表达上调[19]。热休克蛋白（heat shock protein 90α，Hsp90α）广泛存在于生物细胞中，具有维持细胞稳态的作用，随着肿瘤恶性程度增高，Hsp90α 表达水平随之升高[20]。张茂川等[21]研究发现，Hsp90α非小细胞肺癌患者血浆中的表达显著高于健康体检者，提出Hsp90α 可作为非小细胞肺癌辅助诊断的肿瘤标志物。蛋白互作PPI 网络中涉及关键蛋白有IL-6、TNF、JUN、MYC[l12]和PTGS2 等。TNF 即肿瘤坏死因子，是机体重要的细胞因子，调控细胞凋亡、细胞免疫的功能。符一宁等[22]研究发现，吉西他滨联合顺铂能改构人肿瘤坏死因子，治疗非小细胞肺癌，还可以降低患者抑制因子、胸苷激酶-1 表达水平。白介素-6（IL-6）是由T 细胞与成纤维细胞活化后产生的淋巴因子，参与炎症反应。JUN 是原活化的蛋白激酶（MAPK）信号通路的成员之一，参与调节细胞凋亡等生理活动。有文献报道[11]，在康艾注射液治疗非小细胞肺癌（NSCLC）中，观察指标有血管内皮生长因子（VEGF）、TNF-α 和IL-10 等。本研究挖掘出PTGS2、Hsp90α、IL-6、JUN 和MYC 等，经证实这些蛋白在肿瘤细胞形成、生长、凋亡中起到重要作用。本研究挖掘的化合物（如山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等）具有抗癌生物活性，作用于上述蛋白靶点鲜有报道。

对GO 功能富集分析发现，康艾注射液治疗非小细胞肺癌的基因功能主要体现在细胞增殖调控、细胞氧化反应、细胞信号传导和内源刺激反应等方面。KEGG 通路涉及癌症通路、白介素-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、雌激素受体信号传导通路和NF-kappa B 信号通路，推测康艾注射液的有效成分可以作用于这些通路来达到抗NSCLC。NF-kappa B 又称核转录因子-κB，具有多种生理功能的转录因子，该通路参与调控多种恶性肿瘤的形成[23]。NF-κB 能增加抗凋亡基因Bcl-2 的表达，减少变异细胞的凋亡，导致肺癌的发生[24]。此外，NF-κB可以上调CDK1、CDK2、cyclinA、cyclinB 和P-CDC2等，促使肺癌细胞G1/S、G2/M 期过渡，加快肺癌细胞的增殖[25]。路颜增等[11]研究康艾注射液辅助化疗药物治疗晚期肺癌，发现该药能显著降低TNF-α 表达水平，有效缓解晚期肺癌患者的炎症状态，减轻毒副反应，提高机体免疫力。康艾注射液对白介素-17信号通路和雌激素受体信号通路研究较少，是否通过上述通路来抑制NSCLC 需要深入研究。

综上所述，本研究采用网络药理学的技术与方法，筛选出的化合物药理作用、作用靶点、信号通路与现有康艾注射液研究报道基本一致，相比而言，初步阐释了康艾注射液发挥药效的物质基础，为进一步深入研究奠定基础。此外，挖掘出康艾注射液能通过多个靶点、多条信号通路抗非小细胞肺癌，为进一步研究化疗药物辅助用药提供参考依据。