UPLC 法测定维C 银翘片中6 种有效成分的含量
2021-05-08周亚菁沈于兰
周亚菁,沈于兰
无锡市药品安全检验检测中心,无锡 214028
维C 银翘片是由山银花、连翘、牛蒡子、甘草等10 味中药加入对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、维生素C 等3 种化学药加工而成的复方制剂[1],本品临床主要用于治疗流行性感冒引起的发热、头疼、咳嗽、口干、咽喉疼痛等症[2]。《中国药典》2015 年版对维C银翘片质量标准中分别采用高效液相色谱(HPLC)法测定绿原酸、牛蒡苷、维生素C、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏含量,其测定的5 种成分采用几种不同的流动相系统分别检测,实际操作繁琐、工作效率低[3],且未对甘草和连翘两味中药进行质量控制。
目前尚未有文献报道采用UPLC 法同时测定维C 银翘片中的多种成分。现采用UPLC 梯度洗脱,同时测定维C 银翘片中6 种成分(维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷)的含量,与药典方法相比,少了马来酸氯苯那敏的测定,增加了连翘苷、牛蒡苷的测定,优化了质量控制方法。
1 仪器与药品、试剂
UPLC(美国Waters 公司);电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。
样品:市售维C 银翘片:(厂家A:批号:C20180723、厂家B:批号:181032、厂家C:批号:180356);规格:每片含维生素C 49.5 mg、对乙酰氨基酚105 mg、马来酸氯苯那敏1.05 mg。
对照品:维生素C(批号:100425-201504,纯度:100%)、对乙酰氨基酚(批号:100018-201610,纯度:99.9%)、绿原酸(批号:110753-201817,纯度:96.8%)、甘草苷(批号:111610-201908,纯度:95.0%)、连翘苷(批号:110821-201816,纯度:95.1%)、牛蒡苷(批号:110819-201812,纯度:95.0%),均购于中国食品药品检定研究院。
乙腈、甲酸为色谱级;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色 谱柱:Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm ×100 mm,3.0 μm);流动相:水(A),0.1%甲酸-乙腈(B),梯度洗脱:0~8 min、2%~15%B,8~25 min、15%~30%B,25~40 min、30%~5%B,40~45 min、5%~2%B;检测波长:280 nm;柱温:25 ℃;流速:0.2 mL·min-1;进样量:2 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液分别精密称取绿原酸对照品10.416 mg,置5 mL 量瓶中;甘草苷对照品4.872 mg,置50mL 量瓶中;连翘苷对照品17.962mg,置100mL量瓶中;牛蒡苷对照品18.240 mg,置5 mL 量瓶中;分别加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的对照品贮备液。
精密称取维生素C 对照品68.84 mg,对乙酰氨基酚对照品155.14 mg,再精密加入绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷对照品贮备液各2 mL 置同一20 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度分别为维生素C 3.442 mg·mL-1、对乙酰氨基酚7.749 mg·mL-1、绿原酸0.202 mg·mL-1、甘草苷0.00926 mg·mL-1、连翘苷0.0171 mg·mL-1、牛蒡苷0.347 mg·mL-1的混合对照品贮备液。
精密量取混合对照品贮备液5.0 mL 于10 mL 量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取同一批号的维C 银翘片(厂家A:批号:C20180723)20 片,除去包衣,研细,精密称取细粉约0.25 g,置15 mL 量瓶中,加甲醇适量,超声振荡30 min,放冷,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液,用0.45 μm 微孔滤膜过滤,即得。
2.3 结果
2.3.1 系统适用性试验及专属性考察分别精密量取混合对照品溶液、供试品溶液和单一对照品溶液各2 μL,在“2.1”色谱条件下,分别注入液相色谱仪。
以供试品溶液作为系统适用性溶液,结果表明,维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷6 个成分峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,达到基线分离。理论塔板数按维生素C 峰和牛蒡苷峰计算均不低于8000。
供试品溶液在与6 种对照品色谱相应位置上出现一一对应的色谱峰,相应的DAD 谱图一致,表明方法专属性良好。见图1。
2.3.2 线性关系考察分别精密量取“2.2”项下混合对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、7.0 mL,置10 mL量瓶中,制成标准系列溶液,按“2.1”色谱条件进样测定,以峰面积(Y)和浓度(X,μg·mL-1)作线性回归,得线性方程和相关系数,见表1。6 种成分在各自浓度范围内线性关系良好。
图1 (A)混合对照品溶液、(B)供试品溶液UPLC 色谱图
2.3.3 检测限和定量限以信噪比(S/N)3 作为检测限(LOD),信噪比(S/N)10 作为定量限(LOQ),取“2.2.1”项下制备的对照品储备液,用甲醇稀释不同比例后进样测定6 种成分的检测限和定量限。见表1。
表1 6 种成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限、定量限结果
2.3.4 进样精密度试验精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱峰面积,计算RSD(n=6)。维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的峰面积的RSD 分别为1.3%、0.8%、1.0%、0.7%、1.3%、0.9%。表明仪器精密度良好。
2.3.5 重复性试验取同一批号的维C 银翘片(厂家A:批号:C20180723),按“2.3”项下方法制备供试品溶液,平行6 份。按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱图,按外标法计算各成分含量。计算得维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的平均含量分别为51.78、106.08、1.95、0.098、0.23、4.17 mg·片-1,RSD(n=6)分别为0.5%、1.0%、0.3%、1.1%、1.8%、1.0%,表明方法重复性良好。
2.3.6 稳定性试验取同一批号的维C 银翘片(厂家A:批号:C20180723),按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于0、2、4、8、12 h 测定。维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的峰面积的RSD(n=5)分别为0.9%、0.8%、1.3%、1.1%、1.5%、1.3%。表明6 种成分在室温放置12 h 均稳定。
2.3.7 回收率试验精密称取已知各成分含量的维C 银翘片(厂家A:批号:C20180723)细粉约0.125 g,置15 mL 量瓶中,分别精密加入已知浓度的对照品贮备液(维生素C 2.180 mg·mL-1、对乙酰氨基酚4.391 mg·mL-1、绿原酸0.0807 mg·mL-1、甘草苷0.00463 mg·mL-1、连翘苷0.00855 mg·mL-1、牛蒡苷0.173 mg·mL-1)高、中、低浓度各9、7.5、6 mL,每个浓度各3 份,按“2.1 项”下色谱条件进样测定,记录峰面积,代入标准曲线得各成分的含量,计算回收率,维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的平均回收率依次为99.3536%、98.7488%、97.0363%、93.5348%、101.5961%、96.2097%。
2.3.8 样品测定取样品3 批,按“2.2”项下制备供试品溶液,分别将混合对照品溶液和供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。按外标法计算含量,结果见表2。
表2 样品含量测定结果(n=2)
3 讨论
3.1 检测波长的选择
因为维C 银翘片中所测6 种成分极性差异较大,为了达到同时分析的效果,在190~400 nm 内进行全波长扫描,综合分析各成分的最大吸收波长,最终选取280 nm 作为检测波长。在此波长下6 种成分均具有较好的色谱吸收,且在样品中与相邻的色谱峰可以达到良好基线分离,符合含量检测的要求。
3.2 供试品制备方法的选择
综合考虑所测6 种成分的理化特性[4],它们在水中的溶解度均较小,易溶于甲醇,分别考察了50%甲醇、80%甲醇和纯甲醇溶解稀释样品,并考察不同超声时间(30、45、60 min)的提取效果。结果发现,用纯甲醇提取样品,超声处理30 min,各组分色谱分离度良好,能保证各成分提取完全,干扰少。
3.3 与《中国药典》2015 年版方法的比较
在《中国药典》2015 年版一部中规定:每片含绿原酸、牛蒡苷分别应不得少于1.5 mg、2.5 mg;所含维生素C、对乙酰氨基酚应为标示量的90%~110%。采用此药典方法检测维C 银翘片,结果见表3。
表3 《中国药典》方法结果
对比表2 所测4 种成分结果,本法与药典法的4 种成分的含量测定结果基本一致。
4 小 结
建立了UPLC 法测定维C 银翘片中多指标成分的含量,解决了HPLC 法分析时间长、耗用试剂量大的缺点,操作简便、有机溶剂消耗少、灵敏度高、重现性好,对维C 银翘片的质量控制方法作了优化。