β-榄香烯抗DDP 耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP作用及机制研究

陈心蕊，周宋汇，汪瑞辰，许 丽

江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院，南京 210009

卵巢癌是最常见的妇科肿瘤，由于其发病较为隐匿，大部分患者在确诊时已经处于中晚期，因而卵巢癌致死率极高[1]，严重危害了女性的健康。当前对于卵巢癌的治疗主要采用手术和化疗的手段，而铂类制剂依然是化疗的主要药物[2，3]，尽管化疗前期能够较好地杀伤肿瘤细胞，但是随着使用周期的延长，肿瘤细胞极易产生顺铂（DDP）的耐药性[4，5]，大大降低了临床治疗效果，降低患者生存期，因而探寻能够逆转卵巢癌的治疗方法，是当前抗卵巢癌研究的热点和难点。近年来，越来越多的文献指出，中药莪术中的β-榄香烯具有显著的抗乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤的活性[6]，更有研究表明，其具有逆转结肠癌耐长春新碱的作用[7]，表明β-榄香烯可能成为一种良好增强化疗药物效应的药物。相关理论认为，肿瘤细胞能够通过多种方式产生化疗药物耐药作用，其最主要的机制是肿瘤细胞通过表达多种蛋白、包括多药耐药性蛋白（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）、肺耐药相关蛋白（lung-resis-tance-related protein，LRP）和P-糖蛋白（P-gp），这些蛋白能够直接与化疗药物结合，通过细胞胞吐作用将药物转运出细胞[8，9]。故而抑制耐药蛋白的表达有望能够逆转卵巢癌的耐药作用。本研究主要探讨β-榄香烯对DDP 耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP 的直接抑制效应，并研究其逆转顺铂耐药的作用，进一步对其作用机制进行探讨。

1 材 料

1.1 肿瘤细胞株

SKOV3/DDP 耐药卵巢癌细胞（江苏凯基生物有限公司）。

1.2 药品与试剂

McCoy’s 5a 细胞培养基（美国Hyclone 公司，批号：AC13430972）；胎牛血清（上海吉泰生物科技公司，批号：11H228）；β-榄香烯（成都植标化纯生物技术有限公司，纯度≥98%，批号：190627）；顺铂注射液（江苏豪森药物有限公司，批号：601191902，规格：1 mL 注射液含DDP 5 mg）；CCK-8 细胞活力检测试剂（日本Dojindo 化学科技公司，批号：FH783）；细胞凋亡流式检测试剂盒（江苏凯基生物有限公司，批号：20191123）；ABCB1、LRP 和P-gp 蛋白一抗（美国CST 生物公司）；GAPDH 蛋白一抗（武汉三鹰生物公司）；蛋白二抗（南京巴傲德生物公司）；Ripa 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒等（上海碧云天公司）。常规化学试剂，均为化学纯，来源于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

细胞培养二氧化碳孵箱（美国Thermo Fisher公司，型号：3110）；倒置显微镜（日本Olympus 公司，型号：CKX53）；多功能酶标仪（美国Thermo Fisher 公司，型号：Multiskan Fc）；流式细胞仪（美国BD 公司，型号：Accuri C6）；蛋白凝胶成像系统（美国Bio-RAD 公司，型号GelDoc）。

2 实验方法

2.1 CCK-8 法检测β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞增殖的影响

SKOV3/DDP 细胞采用含10%胎牛血清的Mc-Coy’s 5a 完全培养基进行培养，待细胞处于对数生长期时，采用胰酶消化、离心和计数，完全培养基重悬细胞计数板计数后，调整细胞浓度为2×105/mL，以每孔200 μL 体积接种于96 孔无菌细胞培养板中。细胞培养24 h 贴壁后，分别加入0、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1的β-榄香烯于细胞培养板中，每个药物组设置6 个复孔，继续培养48 h。药物作用结束后，每个细胞孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，轻轻敲击培养板进行混匀，将培养板继续置于培养箱中孵育2 h。孵育结束后，取出培养板置于酶标仪450 nm 波长处，检测每孔的吸光度值A450。

细胞增殖抑制率（%）=（1-A药物组/A对照组）×100%。

2.2 克隆形成实验检测β-榄香烯对SKOV3/DDP细胞单细胞克隆生成能力的影响

实验分为空白对照组、β-榄香烯（20、40、80μmol·L-1）剂量组。分别取处于对数生长期的SKOV3/DDP细胞200 个，接种于不同6 孔培养板中，轻轻转动该培养板使细胞分散均匀。待细胞培养24 h 贴壁后，弃去原有培养基，更换含有相应药物的培养基，放于培养箱中静置培养14 天。培养结束后，弃去培养基，无菌PBS 浸泡清洗培养孔2 次，无水甲醇固定细胞10 min，小心吸去甲醇，微晾干后加入瑞士吉姆萨染液进行染色10 min，染色结束，吸去染液，PBS 清洗2 遍后，自然晾干后进行拍照，采用Image J 软件对细胞克隆数进行计数分析。

2.3 流式细胞术检测β-榄香烯对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响

实验分为空白对照组、β-榄香烯（20、40、80μmol·L-1）剂量组。取处于对数生长期的SKOV3/DDP 细胞分别接种于不同6 孔细胞培养板中，每孔接种细胞数为5×105个，细胞培养24 h 贴壁后，弃去原有培养基，加入含有药物的培养基继续培养48 h。培养结束后，弃去培养基，PBS 清洗3 遍后，采用胰酶消化，收集细胞，PBS 清洗2 遍后，离心收集全部细胞至新的无菌EP 管中，加入500μL 的流式上样缓冲液，移液器轻轻吹打混匀细胞；每个离心管中加入5μL的Annexin V-FITC，移液枪混合均匀；继续加入5 μL 的碘化丙啶（propidium iodode，PI），移液枪轻轻吹打使混合均匀。将整个混匀后的体系置于室温避光环境中充分反应10 min，待反应结束，过200 目筛上机检测。实验重复3 次，计算细胞凋亡数。

2.4 CCK-8 检测β-榄香烯逆转SKOV3/DDP 细胞对DDP 的耐药作用

取对数生长期的SKOV3/DDP 细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，以每孔200 μL 体积接种于96 孔无菌细胞培养板中。细胞培养24 h 贴壁后，分别加入0、2、4、8、16、32、64 mg·L-1的DDP 于细胞培养板中，除空白对照组之外每孔加入10μmol·L-1的β-榄香烯，每个药物组设置6 个复孔，继续培养48 h。药物作用结束后，每个细胞孔中加入10μL 的CCK-8溶液，轻轻敲击培养板进行混匀，将培养板继续置于培养箱中孵育2 h。孵育结束后，取出培养板置于酶标仪450 nm 波长处，检测每孔的吸光度值A450。

逆转耐药指数（resistance index，RI）=药物单独作用耐药细胞IC50/药物联合逆转剂共同作用耐药细胞IC50。

2.5 Western blot 法检测β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞耐药蛋白表达的影响

取处于对数生长期的SKOV3/DDP 细胞接种于6 孔细胞培养板，每孔接种数量为2×105个，培养体系为2 mL，实验分为4 组：空白对照组、β-榄香烯（20、40、80 μmol·L-1）剂量组，细胞处理和给药方法同方法“2.3”。待药物作用48 h 后，弃去培养基，RIPA 裂解液充分裂解细胞，提取细胞总蛋白，经BCA蛋白定量后，调整蛋白浓度，加入上样缓冲液制备上样蛋白。制备完毕后，参照蛋白电泳方法进行SDS-PAGE 蛋白电泳。电泳结束后，转膜1.5 h，脱脂奶粉封闭2 h 后，加入经1000 倍稀释的ABCB1、LRP、P-gp 蛋白一抗和GAPDH 蛋白一抗，将膜置于4 ℃中孵育过夜。次日，去除一抗洗膜后加入2000倍稀释的蛋白二抗，室温继续孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次后，凝胶成像系统进行曝光，采用Image J 软件对蛋白条带进行灰度值分析，实验以目标蛋白与内参GAPDH 蛋白灰度值的比值计算目标蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

2.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，样本均数间比较采用LSD-t 检验，采用Graphpad 5.0 软件进行绘图。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞增殖的影响

CCK-8 实验结果显示，β-榄香烯20、40、80、160、320 μmol·L-1对SKOV3/DDP 细胞增殖有明显抑制作用，且与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。然后采用β-榄香烯20、40、80 μmol·L-1剂量研究β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞的直接作用。β-榄香烯10 μmol·L-1并不能直接抑制SKOV3/DDP 细胞增殖，见图1。

图1 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞增殖的影响（，n=6）

3.2 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞克隆形成的影响

克隆形成实验结果显示，β-榄香烯20、40、80 μmol·mL-1组对SKOV3/DDP 细胞克隆形成数明显减少，且与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，β-榄香烯能够抑制SKOV3/DDP 细胞的克隆生成。见图2。

图2 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞的克隆生成的影响（，n=6）

3.3 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞凋亡的影响

流式细胞术实验结果显示，β-榄香烯20、40、80 μmol·L-1组对SKOV3/DDP 细胞凋亡明显增加，且与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，β-榄香烯能够促进SKOV3/DDP 细胞的凋亡。见图3。

图3 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞凋亡的影响（，n=6）

3.4 β-榄香烯逆转SKOV3/DDP 细胞对DDP 的耐药作用

CCK-8 实验结果显示，随着DDP 浓度的升高，对SKOV3/DDP 细胞的抑制率逐渐升高。β-榄香烯和DDP 联合使用组对SKOV3/DDP 细胞的抑制率明显增高，与DDP 组相比差异具有统计学意义。SKOV3/DDP 细胞对DDP 的IC50为17.54 mg·L-1，在β-榄香烯联合作用下，SKOV3/DDP 细胞对DDP 的IC50下降为6.78 mg·L-1，β-榄香烯能够逆转SKOV3/DDP 细胞对DDP 的耐药，且逆转倍数为2.58 倍。见图4。

3.5 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞耐药相关蛋白ABCB1、LRP 和P-gp 的影响

图4 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞DDP 耐药的逆转作用（，n=6）

为研究β-榄香烯抑制SKOV3/DDP 细胞作用的机制，对SKOV3/DDP 细胞中的多药耐药相关蛋白进行研究。Western Blot 实验结果显示，ABCB1、LRP、P-gp 在SKOV3/DDP 细胞中明显高表达，在β-榄香烯20、40、80 μmol·L-1组SKOV3/DDP 细胞中的ABCB1、LRP、P-gp 均明显降低，且与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，β-榄香烯对卵巢癌细胞的抑制作用和逆转耐药作用，可能与抑制SKOV3/DDP 细胞中的耐药蛋白的表达水平有关。见图5。

图5 β-榄香烯对SKOV3/DDP 细胞ABCB1、LRP 和Pgp 耐药蛋白表达的抑制作用（，n=6）

4 讨论

卵巢癌是一种高致死性的妇科肿瘤，而采用顺铂进行化疗是卵巢癌规范化治疗的必须环节，能够大大提高患者的总体生存率和生存期[10]。然而，临床研究发现，肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性是化疗失败的主要原因[11]，因而合理使用化疗药物或联合使用其他药物逆转肿瘤细胞耐药是当前肿瘤治疗的重要课题。卵巢癌能够表达多种肿瘤耐药蛋白，这些蛋白能够通过直接与化合物结合、促进胞吐作用或促进化疗药物外排，从而产生化疗药物耐药[12]，因此抑制耐药蛋白的表达，以此为靶点开发合理的联合药物有望逆转肿瘤细胞耐药，增强化疗药物的疗效。

β-榄香烯是中药姜黄属温郁金中的主要活性成分，已经被证实是一种广谱的抗肿瘤成分[6]，现已研制成榄香烯注射液用于联合其他药物对肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤的治疗;但是对于其增强化疗药物疗效是否与直接杀伤肿瘤细胞和或逆转肿瘤耐药作用有关还不得而知。

本研究将DDP 耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP作为研究对象，采用不同浓度的β-榄香烯进行直接作用，研究β-榄香烯对耐药的卵巢癌细胞的抑制作用，并采用不具有直接细胞毒作用的剂量联合顺铂进行给药处理，研究β-榄香烯逆转肿瘤细胞耐药的作用。实验结果显示，β-榄香烯（20、40、80 μmol·L-1）各浓度能够抑制SKOV3/DDP 细胞的增殖、克隆生成并促进细胞凋亡。进一步联合用药后，发现在无直接细胞毒性10 μmol·L-1浓度下，β-榄香烯能够逆转SKOV3/DDP 细胞对顺铂的耐药作用，其逆转耐药的倍数为2.58 倍。这一结果充分证实，β-榄香烯能够对耐药的卵巢癌细胞产生抑制作用，且也能够逆转肿瘤细胞耐药，表明其具有良好的抗肿瘤效应。

长期使用化疗药物后，未被杀死的肿瘤细胞能够表达耐药蛋白，这些耐药蛋白通过将化疗药物转运出细胞、从而实现肿瘤细胞的多药耐药，其中ABCB1、LRP、P-gp 是最主要的耐药蛋白[13，14]，它们在卵巢癌患者中高表达。本研究通过Western blot实验结果显示，在SKOV3/DDP 细胞中，ABCB1、LRP和P-gp 表达水平较高，而β-榄香烯能够剂量依赖性的抑制这几种耐药蛋白的表达，结果表明，β-榄香烯逆转SKOV3/DDP 细胞多药耐药的作用机制可能与抑制耐药蛋白的表达有关。

综上所述，本研究结果表明，β-榄香烯可以抑制SKOV3/DDP 细胞的增殖生长、促进细胞凋亡，也能够逆转SKOV3/DDP 细胞顺铂耐药，同时对ABCB1、LRP 和P-gp 多种耐药蛋白表达具有较强的抑制作用。本研究提示，β-榄香烯能够通过抑制多种耐药蛋白的表达发挥抗SKOV3/DDP 细胞和逆转化疗药物耐药的作用，其成药性值得后续深入探讨。