鸡白痢沙门菌sptP 基因缺失株的构建及其免疫保护效力评价

殷俊磊 张艳芳 邹凡雨 潘鹏涛 段艳红 仇书兴

（新乡学院生命科学与基础医学学院，新乡 453003）

由鸡白痢沙门菌（SalmonellaPullorum）引起的鸡白痢（Pullorum disease）是一种全身系统性疾病，多侵害3 周龄以内的雏鸡，以白色黏稠样下痢和急性败血症为主要临床特征，发病率和死亡率极高，最高可达100%；对日龄较大的青年鸡亦可致病和致死；受感染的成年鸡一般不发病，但其生产性能会下降，受污染种蛋的孵化率和出雏率明显降低，垂直传播一直是制约该病净化的关键因素之一［1］。目前，该病在很多国家（如中国、俄罗斯、巴西、英国、法国、孟加拉国、尼日利亚、阿根廷、印度等）仍有一定程度的发生和流行，严重制约着养鸡业的健康发展，并给养鸡业带来了巨大的经济损失［2-3］。

目前，进行药物控制和淘汰发病鸡（群）是防控该病的常用策略，但药物控制会引起耐药性和药物残留等诸多问题，并且耐药性可经食物链传播给人类；而淘汰发病鸡（群）的方法严重受到社会发展水平的制约，控制成本较高，在很多国家实施起来有一定的困难［4-5］。疫苗接种是一个较好的预防沙门菌病的方法，如灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗等，但当前尚没有专门针对鸡白痢沙门菌的商品化减毒活疫苗［6］。

SptP 蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，与沙门菌毒力密切相关，可经沙门菌致病岛1（SPI1）Ⅲ型分泌系统（T3SS）分泌发挥作用，其分泌需要分子伴侣Scip 的协助，SptP 具有耐高温和耐盐性［7］。沙门菌感染宿主细胞初期，SptP 可抑制细胞膜皱褶的形成，参与宿主细胞骨架的重排，以利于沙门菌在宿主细胞内的存活和增殖［8］。研究显示，sptP基因的缺失会引起肠炎沙门菌的毒力显著下降，并且该缺失株可诱导小鼠产生显著的免疫应答反应，为小鼠提供有效的免疫保护［9］，而在鸡白痢沙门菌中尚未见到相关报道。这为基于sptP基因缺失研发鸡白痢疫苗提供了思路。

因此，本研究拟利用基因工程方法构建鸡白痢沙门菌sptP基因的缺失突变株C79-13ΔsptP，并分析其生长、生化及毒力等基本生物学特性，然后评价该缺失株对3 日龄雏鸡的口服免疫效果，以期为基于sptP基因鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的研发提供数据。

表1 PCR 扩增的引物序列

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及实验动物 鸡白痢沙门菌C79-13 购自中国兽医药品监察所；质粒pkD46（氨苄青霉素抗性，Ampr）、pKD3（氯霉素抗性，Cmr）、pCP20（Ampr，Cmr）和pBR322-sptP（Ampr）等 均由本实验室保存；实验用海兰白雏鸡（沙门菌抗体阴性）由北京艾普希隆生物科技有限公司提供的鸡胚自孵。复苏细菌时挑单菌落在LB 液体培养基于37℃，180 r/min 条件下过夜培养。根据需要加入终浓度100 μg/mL 的氨苄青霉素（Amp）或34 μg/mL的氯霉素（Cm）。

1.1.2 主要试剂TaqDNA 聚合酶、高保真DNA 聚合酶和DNA 胶回收试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌微量生化发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；L-阿拉伯糖与HRP 标记的兔抗鸡IgG 抗体购自Sigma 公司；TMB 显色液购自碧云天生物技术研究所；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI 1640 培养液和胎牛血清购自Gibco 公司；Amp 和Cm 购自生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物 根据GenBank 中公布的鸡白痢沙门菌sptP基因序列及相关参考文献［9］，利用软件Primer 5.0设计出特异性引物（表1）。F1/F2 为用于同源重组的引物对，每条引物分别由两部分组成，其中5'端大写部分序列与sptP基因为同源或互补序列，3'端小写部分序列与质粒pKD3 上的氯霉素序列为同源或互补序列；CX1/CX2 缺失株构建后的PCR 验证及测序引物；H1/H2 为互补株的验证引物。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 鸡白痢沙门菌sptP基因缺失株C79-13ΔsptP及其互补株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的构建以pKD3 为模板，用引物F1/F2 进行PCR 扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，将其回收、纯化用作打靶片段，电转化到诱导表达了重组蛋白的C79-13/pKD46 感受态细胞中，经Amp 和Cm 筛选pKD46 丢失的菌株C79-13ΔsptP∷Cm，电转化pCP20 至感受态的C79-13ΔsptP∷Cm，利用温度敏感性、抗性及PCR 和测序鉴定构建鸡白痢沙门菌sptP基因缺失株C79-13ΔsptP；然后将本实验室保存的互补质粒pBR322-sptP电转化至感受态的C79-13ΔsptP，Amp 抗性平板筛选阳性克隆子，经PCR 鉴定构建互补株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）［10］。

1.2.2 C79-13ΔsptP的生长和生化特性鉴定 分别挑 取 鸡 白 痢 沙 门 菌C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的单菌落接种于LB 液体培养基中培养过夜，第2 天分别转接至15 mL 的LB液体培养基中，调节初始OD600的值为0.05，37℃，200 r/min 摇振培养，连续14 h，每隔2 h 取样和测定OD600值，并绘制细菌的生长曲线。同时，分别挑取这3 株菌的单菌落接种于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、丙二酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氢等生化鉴定管，37℃过夜，观察生化鉴定结果。

1.2.3 C79-13ΔsptP对雏鸡的毒力试验 分别以PBS洗涤在LB 液体培养基中培养过夜的C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）菌株3 次并悬浮，根据需要进行连续10 倍倍比稀释，每个稀释度给10 只2 日龄雏鸡进行口服，另设置PBS 对照组，每只500 μL，分组情况及攻毒剂量见表2，连续观察14 d 并统计死亡情况，根据Bliss 法计算各菌株的LD50，评价其毒力。

1.2.4 免疫对雏鸡体重变化及临床表现的影响 将60 只3 日龄雏鸡随机分为2 组，分别为免疫组（n=25）和对照组（n= 35），免疫组每只雏鸡的口服接种剂量为100 μL 含1.0 × 108CFU 的C79-13ΔsptP，对照组每只雏鸡仅口服接种100 μL PBS。在接种后的第5、12 和19 天分别测定免疫组和对照组雏鸡的体重，同时观察并记录雏鸡的临床状态。

1.2.5 血清IgG 水平的测定 分别于免疫后的第7、14 与21 天从每组鸡群中随机取5 只进行血液（抗凝）样品的采集，分离部分血液样品血清，淘汰采样鸡。取免疫后第7、14 与21 天采集的血液样品分离血清，以1∶50 稀释作为一抗，HRP 标记的兔抗鸡IgG 抗体（1∶10 000）作为二抗，以加热灭活的鸡白痢沙门菌C79-13 株PBS 悬液作为抗原进行包被，应用间接ELISA 测定血清抗体在492 nm 的吸光值（OD492）来确定IgG 水平［11］。

1.2.6 外周血淋巴细胞增殖试验 取免疫后第7、14 与21 天采集的血液样品，利用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，台盼蓝染色、计数，调整淋巴细胞浓度至5.0 × 106个/mL，96 孔板每孔接种100 μL 完全培养基悬浮的淋巴细胞悬液，41℃、5%CO2培养箱孵育48 h，用鸡白痢沙门菌C79-13 制备可溶性抗原；然后用三磷酸腺苷发光法测量淋巴细胞的增殖活性，结果用刺激指数（Stimulation index，SI）表示［11-12］。

1.2.7 攻毒试验 于免疫后第10 天随机从免疫组中取出10 只，命名为A 组；从对照组中取出20 只，分成B 组和C 组，每组10 只。用鸡白痢沙门菌C79-13 株以2.0 × 109CFU/只的剂量经口服对A 组和B 组进行攻毒，C 组仅接种100 μL PBS。攻毒后连续观察21 d 各组雏鸡的死亡情况，并记录其临床表现。

1.2.8 数据统计 采用GraphPad Prism 软件分析处理，数据用平均值±标准误（mean ± SEM）表示，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 缺失株C79-13ΔsptP及其互补株的鉴定

利用引物CX1/CX2 分别对筛选的鸡白痢沙门菌C79-13、C79-13ΔsptP：：Cm 和C79-13ΔsptP基因组进行PCR 扩增，分别出现了2 160 bp、1 561 bp和631 bp 的条带（图1-A），然后对扩增的631 bp的条带进行回收、纯化和测序，扩增结果和测序结果均与预期结果一致，表明成功构建了缺失株C79-13ΔsptP。分别利用引物H1/H2 和CX1/CX2 对筛选C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）基因组进行PCR 扩增，分别出现391 bp 和631 bp 的条带（图1-B），扩增结果与预期结果一致，证明成功构建了缺失株C79-13ΔsptP的互补株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）。

图1 鸡白痢沙门菌sptP 基因缺失株（A）及其互补株（B）的PCR 鉴定

2.2 C79-13ΔsptP的生长和生化特性测定

如图2 所示，绘制的鸡白痢沙门菌C79-13、C79-13ΔsptP和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的生长曲线基本一致，在生长速度上没有明显差异（P＞0.05），说明缺失sptP对鸡白痢沙门菌C79-13 的生长特性没有影响。生化特性测定结果显示，3 株细菌的生化特性一致，均能发酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶，而不能发酵蔗糖、麦芽糖、山梨醇、乳糖、丙二酸盐、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氢等，说明缺失sptP不影响鸡白痢沙门菌C79-13 的生化特性。

2.3 C79-13ΔsptP的毒力测定

毒力测定结果见表2，鸡白痢沙门菌C79-13 对2 日龄雏鸡的LD50为3.16 × 106CFU，缺失株C79-13ΔsptP对雏鸡的LD50大于1.00 × 109CFU，互补株C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）对雏鸡的LD50为6.90× 106CFU，C79-13ΔsptP的LD50至少是其亲本野生株C79-13 的316.5 倍，说明缺失sptP会引起鸡白痢沙门菌毒力的显著下降，当回补了sptP基因时，其毒力也随之回复。

图2 C79-13、C79-13ΔsptP 和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的生长曲线

表2 C79-13、C79-13ΔsptP 和C79-13ΔsptP（pBR322-sptP）的毒力测定

2.4 免疫后雏鸡的体重变化及临床表现

鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP经口服途径免疫3 日龄雏鸡后不同天数各组雏鸡的平均体重见表3，免疫组与对照组鸡群之间的体重差异并无统计学意义（P＞ 0.05）。与对照组一样，免疫组雏鸡的状态表现正常，未出现厌食、腹泻、精神萎靡或死亡等临床症状。

表3 免疫后不同天数雏鸡体重变化情况

2.5 血清IgG水平的测定

经口服免疫后减毒株C79-13ΔsptP诱导雏鸡产生的血清IgG 水平检测结果见图3，免疫组雏鸡血清IgG 水平在免疫后第7、14 与21 天均显著高于对照组（P＜ 0.05），说明C79-13ΔsptP能够显著诱导雏鸡产生体液免疫应答反应。

图3 雏鸡血清IgG 水平的测定

2.6 外周血淋巴细胞增殖活性测定

结果如图4 所示，免疫组鸡群外周血淋巴细胞增殖活性在免疫后第7、14 与21 天均显著高于对照组（P＜ 0.05），说明C79-13ΔsptP能够显著诱导鸡群产生细胞免疫应答。

图4 雏鸡外周血淋巴细胞增殖活性的测定

2.7 攻毒试验

于免疫后第10 天利用鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP的亲本强毒株C79-13 进行攻毒，连续观察21 d，结果显示，与存活状态良好的C 组鸡群相比，A 组鸡群有轻微的厌食、腹泻及精神萎靡等临床症状出现，4-7 d 即可恢复，未出现死亡病例，而B 组则有严重的厌食、腹泻、精神萎靡等临床症状出现，最后全部死亡，说明减毒株C79-13ΔsptP为鸡群提供了良好的免疫保护。

3 讨论

生物技术的飞速发展为研究病原微生物的致病机理提供了丰富的技术手段。当前，已有许多沙门菌毒力因子被鉴定，基因sptP便是其中之一。沙门菌侵入宿主细胞后可通过在形成沙门菌液泡（SCV）来逃避宿主细胞的清除作用，并在SCV 内进行存活和增殖［13］。研究显示，SptP 蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，可促进沙门菌在SCV 内的增殖，并且该蛋白还具有负调控MAPK 等信号通路的功能；sptP基因的缺失会引起肠炎沙门菌的毒力显著下降，且该缺失株保留了良好的免疫原性［7，9，14］，但sptP基因缺失在鸡白痢沙门菌中的相关研究报道尚未见到。

目前，λ-red 同源重组技术被广泛用于大肠杆菌、沙门菌等细菌的基因缺失株构建，并且该技术不会对缺失基因的下游基因产生极性效应［15］。本研究首先利用λ-red 同源重组技术构建了鸡白痢沙门菌C79-13 的sptP基因缺失株C79-13ΔsptP，发现缺失sptP基因对鸡白痢沙门菌C79-13 的生长和生化特性均没有影响，说明sptP基因对鸡白痢沙门菌的生长代谢没有影响；毒力试验结果表明，sptP基因与鸡白痢沙门菌的致病性密切相关，其缺失会引起鸡白痢沙门菌的毒力显著下降，且sptP缺失引起鸡白痢沙门菌毒力下降的幅度大于SPI2、spiC、crp、asd、fur及speDE等毒力因子缺失引起鸡白痢沙门菌毒力下降的程度［11，16-18］。有研究显示，在肠炎沙门菌缺失sptP基因后，其对肠炎沙门菌生长和生化特性均没有影响，但引起肠炎沙门菌对小鼠毒力的显著下降，这与本研究结果一致［7］。

理想的疫苗，尤其是减毒活疫苗应该是无毒性的。SG9R 因为其残留的毒性和有争议的保护效果一直为人们所诟病［19］。有报道显示，鸡白痢沙门菌SPI2、spiC、crp、asd、fur及speDE等毒力因子缺失株可诱导机体产生显著的体液和细胞免疫应答，为雏鸡提供高效的免疫保护效力［11，16-18］，这些研究为沙门菌减毒疫苗的研发提供了良好的数据。本研究结果表明，鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP以1.0 × 108CFU 的剂量经口服免疫3 日龄雏鸡后并不影响其生长性能，也不会引起就鸡群的任何不良反应，这是疫苗安全性评价的一个重要指标。通常情况下，免疫后减毒沙门菌能够诱导动物机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，其免疫应答水平的高低也是评价沙门菌减毒疫苗免疫效果好坏的一项重要指标［20］。我们通过检测血清IgG 的水平评价了减毒株C79-13ΔsptP诱导雏鸡产生体液免疫应答的能力，结果显示，体液免疫应答水平被显著诱导。血液中T 淋巴细胞的增殖活性可间接反映机体细胞免疫的水平，外周血中成熟淋巴细胞的数量也反映着动物机体细胞免疫的功能强弱［6］。本研究中的外周血淋巴细胞增殖试验结果显示，减毒株C79-13ΔsptP能够显著诱导雏鸡产生细胞免疫应答反应。攻毒试验结果表明，减毒株C79-13ΔsptP对雏鸡提供了有效的免疫保护。以上结果表明，鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP具有作为疫苗候选株的潜力。有研究显示，sptP基因缺失的减毒肠炎沙门菌经免疫后可诱导小鼠和雏鸡产生显著的体液和细胞免疫应答反应，具有良好的安全性，能提供高效的免疫保护，这与本研究结果一致［9，14］。本研究仅初步表明鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP具有作为减毒活疫苗的潜力，但后续还有很多工作需要去完成，如免疫途径的选择、最佳免疫剂量的探索等，均有待于进一步研究。

4 结论

本研究成功构建了鸡白痢沙门菌减毒株C79-13ΔsptP，基因sptP的缺失会引起鸡白痢沙门菌的毒力显著下降。经口服免疫后，C79-13ΔsptP不影响雏鸡的生长性能，能够诱导雏鸡产生显著的体液免疫和细胞免疫应答反应，为雏鸡提供高效的免疫保护效力，具有作为鸡白痢减毒口服疫苗的潜力。