褪黑素对玉米幼苗根系发育和抗旱性的影响

马旭辉 陈茹梅 柳小庆 赵军 张霞

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

玉米是我国第一大粮食作物，2019 年种植面积达4.13×108hm2，总产量达2.61×108t，种植面积和总产量均位居全球第二，仅次于美国。我国玉米增产对整个粮食作物增产的贡献率达到将近60%，居粮食作物之首，在我国国民经济发展中占有举足轻重的地位，因此玉米的稳产和高产是保障国家粮食安全及相关产业发展的基础。玉米是一种对水分敏感的作物，在生长发育过程中对水的需求都比较大，苗期干旱会造成玉米营养生长缓慢，花期干旱会影响花器官的分化和生长，导致散粉和吐丝间隔延长，造成严重的产量损失。在过去25 年里，干旱使全球玉米产量减少40%左右［1］。在水资源匮乏，气候变化加剧，耕地面积不断减少的大环境下，为保证玉米稳产和高产，必须采取多种措施提高玉米作物抗旱性。目前提高农作物的抗旱性主要采取两种方式，一是加强土壤管理，通过引水浇灌，秸秆还田，深耕土壤等方式；二是通过常规的杂交育种和基因工程手段培育优良的抗旱品种。目前出现了新的方式提高植物对干旱胁迫的耐受力，即使用一些化学制剂（包括亚硝基氰化钠，过氧化氢，硫氢化钠，多胺，褪黑素等）可以提高植物对不同非生物胁迫的耐受力，改善细胞内稳态和植物生长，这些化学试剂被称为诱发剂（Priming）［2］。因此，寻找合适的植物诱发剂来提高作物的抗旱性是提高作物产量的有效途径之一。

褪黑素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxy-tryptamine），是一种吲哚色胺。1958 年，Lerner 等［3］首次从牛的松果体中提取出褪黑素，随后，研究人员陆续在不同的生物体中发现褪黑素的存在，且Tan 等［4］从藻类中分离并鉴定出了褪黑素，证实了植物界中也存在有褪黑素，表明了褪黑素广泛存在于生物体内。据报道，褪黑素参与动物的生长、发育调控和信号转导，在调节植物生长发育方面也起着关键作用，包括营养生长、种子萌发、生根和开花等过程［5-6］。由于褪黑素参与了许多植物的发育过程和逆境反应。2018 年，Kanwar 等［7］对褪黑素在光合作用中的作用、胁迫下的植物激素相互作用、细胞氧化还原信号以及在植物免疫、植物修复和植物微生物相互作用中的其他调节作用进行了全面综述，认为虽然植物褪黑素是一种独立的植物生长调节剂，可以与其他植物生长调节剂或激素相互作用，但它是否可以作为一种完整的植物激素，目前仍有待确定［7］。

根系，作为“承上启下”的主要营养器官，发挥着固持植物体地上组织和汲取地下水分和养分的双重功能，在植物整个生长发育过程中发挥着重要的作用。同时，植物根系也是感知土壤水分匮缺的第一“信使”，能够将土壤水分及养分的信息快速传递到地上部分，使地上组织作出反应，参与植物应对干旱胁迫反应［8］。根系的构型，特指植物根群组成的具有生物功能的复杂的根系空间结构和形态，即各级根轴之间精细的空间扩展方式［9］。根系构型包括根体积、根长、根直径、根总重、根冠比等，主要由遗传因素决定，同时受土壤介质环境、种植密度、植株大小和农业耕作等因素影响。它可以决定植物对水分和营养的吸收，从而影响植物地上部分的生长和抗旱性，对于维持植物在干旱条件下的产量也十分重要。玉米根系属于须根系，按照根系类型建成的发育阶段可以将玉米根系分成：种子萌发时形成的的种子根（Seminal root）或主根（Primary roots）、茎生的节根（Crown roots）和气生根（Brace roots）以及着生于这些根上的侧生根（Lateral roots）［10］。其中主根形成于胚根鞘，种子根形成于中胚轴盾片，且主根会在玉米生长后期发生退化。初生根系、次生根系和气生根系交错分布，共同构成玉米强大而密集的根系系统。玉米在水分胁迫下，根系构型、内部细胞结构、细胞内渗调物质的积累会发生一系列适应性改变，如改变根重和侧根数量、根冠比加大，从而影响地上植株的生长发育，最终影响玉米产量。研究表明，外源添加500 μmol/L褪黑素可以显著促进黄瓜侧根的生长［11］。Zhang等［12］通过GO 和通路富集分析（Pathway enrichment analysis）发现褪黑素促进黄瓜侧根发育的主要作用机制是激活根系中相关激素和转录因子通路，减少根系发育过程中因呼吸作用产生的ROS 损伤。这些研究结果表明褪黑素可以促进一些植物根系的发育，但是褪黑素促进根系发育的具体机制目前还不清楚。

褪黑素已被证明可以增强植物的非生物胁迫能力，包括干旱胁迫、高温胁迫、低温胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等［13-16］。Zhang 等［17］详细的介绍了植物在恶劣环境条件下褪黑激素的调节作用。环境胁迫可以增加植物内源性褪黑激素的水平。褪黑激素生物合成基因的过表达可以提高转基因植物的褪黑素水平，且这些转基因植物对非生物胁迫表现出更强的耐受性。同时外源褪黑素的施加也能提高植物对非生物胁迫的耐受能力。褪黑素介导基因RsMT1（Metallothionein 1）的上调，增强烟草植物对Cd 的耐受性［18］。Yang 等［19］通过转录组分析表明，外源褪黑素主要通过调控参与光合作用、ROS 代谢、类黄酮和褪黑激素生物合成的基因来增强抗氧化保护，提高橡树（Hevea brasiliensis）耐盐胁迫能力。Zhang等研究发现在干旱胁迫条件下，经褪黑素处理的黄瓜（Cucumis sativusL.）植株种子萌发率和根系生长率较高［11］，褪黑素还能改善葡萄插穗时的干旱胁迫［20］。在拟南芥中过表达褪黑素受体（AtPMTR1），导致气孔关闭，提高水分利用效率和耐旱性［21］。虽然已有多项研究表明，使用褪黑素可以提高作物的抗旱性，但对其提高农作物抗旱性的具体作用机制却知之甚少。

因此，本研究采取根灌褪黑素和褪黑素浸种两种外源施用方法，通过萌发纸水培培养和土培盆栽的两种种植方法，探索PEG 诱导的干旱胁迫和土壤控水两种旱处理条件下，外源褪黑素的施用对玉米幼苗根系发育和抗旱性影响的具体表现，深入了解褪黑素改善植物抗旱性的的生理和生化机制，旨为大田中褪黑素的施用方法提供新的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种子 玉米B73 自交系（2017 年10 月收于中国农业科学院廊坊实验基地）。

1.1.2 试剂 褪黑素（购买于Sigma，配制方法：将褪黑素用无水乙醇稀释至100 mmol/L，作为储液保存在-20℃冰箱中），营养液（Hoagland Modified Basal Salt Mixture，H353，Phytotechlab），PEG6000，磷酸缓冲液，过氧化氢（H2O2）含量测定试剂盒（南京建成公司），过氧化物酶（POD）试剂盒（南京建成公司），丙二醛（MDA）含量测定试剂盒（南京建成公司），超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（索莱宝公司），过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（南京建成公司），硝基蓝四唑（NBT）（Amresco，0.1 g NBT溶于50 mmol/L 的磷酸盐缓冲液中），营养土。

1.1.3 仪器和工具 萌发纸（购买于Anchor Paper

公司），恒温培养箱（LHS-80），便携式光合系统CIRAS-3（PP Systems，Amsbury，MA，USA A）仪器，植物效率分析仪（Handy PEA，Handy Plant Efficiency Analyzer），SPAD-502 meter（Konica Minolta，Japan）叶绿素含量测定仪，A3 尺寸平板扫描仪（MICROTEK Plantom，9900XL），万深LA-S 系列植物图像分析系统-根系分析系统。

1.2 方法

1.2.1 浸种盆栽法 用6%次氯酸钠溶液清洗种子20 min达到灭菌的效果，在蒸馏水中漂洗5次后风干。灭菌后的种子放入不同浓度（0 μmol/L，50 μmol/L，500 μmol/L）的褪黑素溶液中1 min，滤纸也用同样浓度褪黑素溶液润湿后置于14 cm 的培养皿中，然后将处理过的种子置于用相同浓度褪黑素浸湿的滤纸上，在27℃恒温培养箱中暗培养。种子萌发后移栽至盆中。这些种子分为两组，第一组将0 μmol/L浓度褪黑素浸泡的种子和50 μmol/L 浓度褪黑素浸泡的种子（每种浓度9 粒种子）栽在长方形的装满营养土的塑料容器（长50 cm，宽30 cm，深15 cm）。第二组将0 μmol/L 浓度褪黑素浸泡的种子和500 μmol/L 浓度褪黑素浸泡的种子（每种浓度9 粒种子）栽在相同的塑料容器中。这些植株平均地生长在温室中。当幼苗发育出四片完全的叶子（处于V4 生长阶段）时，通过停止灌溉使它们处于渐进的缺水状态，直到观察到明显的叶片萎缩，此时土壤含水量接近于0。然后进行相关生理生化指标的测定。

1.2.2 水培根灌法 我们基于水培根灌法来评估外源性褪黑素的施加对根系构型发育的影响。将已消毒的种子放在双层棕色萌发纸上，然后卷起来，并垂直放置在2 L 的烧杯中，加入400 mL 的营养液，置于光照恒温培养室中培养生长（培养条件是28℃，16 h 光照，100 μmol/（m2·s）光照强度；22℃，8 h 黑暗；湿度60%）。种子在萌发纸上萌发5 d 后，发芽卷纸被分为4 组，包括对照组（只添加营养液），试验组I（营养液+15% PEG6000），试验组II（营养液+1 μmol/L 褪黑素），试验组III（营养液+15% PEG6000+1 μmol/L 褪黑素）。所有幼苗再培养7 d，然后收集根系和地上部分，进行根系构型分析和生理生化实验。培养液每两天更换一次。

1.2.3 玉米根系构型分析 手动对玉米根系构型进行分析，包括主根长度，侧根数目和种子根长度等。随后，将幼苗根系放置在扫描仪上，使其漂浮在A3尺寸平板扫描仪的丙烯酸托盘中的水中，避免根系重叠和交叉。通过万深LA-S系列植物图像分析系统-根系分析系统分析，获得根系的长度，表面积，体积和平均直径等。对4 个独立实验的所有植株根系构型都进行测量，每个实验有32 株玉米幼苗。

1.2.4 叶片气体交换参数、叶绿素荧光和叶绿素含量的测定 利用便携式光合系统仪器测定植物的气体交换参数。当土壤中种植的植物叶片发生萎蔫时，在上午（10：00-12：00）时间对植株的第4 片叶子进行气体交换参数测量。同时，使用植物效率分析仪和SPAD 叶绿素仪在相同叶片上测定叶绿素荧光和叶绿素含量。每片叶子进行了3 次独立的测量后取平均值。每个处理条件下测定5 株植株。

1.2.5 测定叶片相对含水量（RWC）和地上及地下部分干重 在进行了上述的光合作用测量之后，采集相同的叶片，按照Turner 中描述的方法对叶片的相对含水量进行测定［22］。从叶中脉和边缘之间的区域剪下5 cm2的叶片样本（避免使用大叶脉），并将其置于预先称重的密封的小瓶中进行称重，获得叶片的新鲜重量（FW），然后在室温下将其浸入蒸馏水中8 h，称量获得叶片的饱和重量（TW）。样品在80℃下烘干24 h，称量获得叶片的干重（DW）。叶片RWC 根据以下公式进行计算。

对于盆栽的植物，取得所有地上组织并烘干3 d（85℃），以确定地上所有部分干重。对水培纸卷培养的植株，将根系部分和地上部分进行分离然后测定。每个处理收集9 个样品进行数据测量。

1.2.6 活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）测定 根据H2O2测定试剂盒中所述的方法测定叶片过氧化氢（H2O2）的含量。根据脂质过氧化（MDA）检测试剂盒的方法测定MDA 的含量。采用原位组织化学染色方法检测超氧阴离子（O2-）的积累。取离体叶片真空浸于NBT 溶液中，放置于25℃黑暗中2 h，然后将样品取出在95%乙醇煮沸去除叶绿素，并拍照记录。

1.2.7 抗氧化酶的活性测定 取0.1 g 叶片样品在冰态磷酸盐缓冲液中研磨，获得组织匀浆。然后将组织匀浆在4℃下，以4 000 r/min 离心10 min，取上清液进行抗氧化酶活性的测定。其中蛋白质浓度的测定使用的是BCA 蛋白浓度测定试剂盒。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定使用的是超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，过氧化氢酶（CAT）活性测定使用的是过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒，过氧化物酶（POD）活性测定采用过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒。

1.2.8 统计分析 数据分析采用方差分析（ANOVA）和最小显著性差异（LSD）检验，采用SPSS 数据处理系统。P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素促进玉米生长发育

水培条件下对玉米植株根部直接施加褪黑素。对地上部分的表型进行观察，正常条件下，褪黑素的施加对植物地上部分的生长发育没有影响。在干旱条件下，植物的生长受到抑制，褪黑素的施加缓解了这种抑制（图1-A）。在盆栽种植条件下，对玉米植株采用种子浸泡褪黑素方法。对地上部分的表型进行观察，正常条件下，施加褪黑素对植物地上部分的生长发育影响不显著。在干旱条件下，植物的生长受到抑制，褪黑素的施加缓解了这种抑制（图1-B）。对玉米的根系和地上部分生物量进行测定，采用根灌褪黑素的方法，在正常条件下，褪黑素的施加对植物的地上部分生物量没有明显影响，但施加褪黑素的植株根系生物量为0.077 6 g，未施加褪黑素的植株根系生物量为0.061 5 g，褪黑素的施加显著提高玉米幼苗的根系发育。在PEG6000 诱导的干旱胁迫条件下，施加褪黑素的植株无论是地上部分还是根系，生物量都显著高于未施加褪黑素的植株（图1-C）。采用种子浸泡褪黑素的方法，在正常条件下和干旱胁迫条件下，施加褪黑素的植株地上部分生物量显著高于未施加褪黑素的植株，其中干旱条件下不同浓度（0 μmol/L vs 50 μmol/L vs 500 μmol/L）褪黑素浸种的玉米幼苗地上部分的生物量分别为0.353 g、0.492 g 和0.307 g（图1-D）。

图1 水培根灌和浸种盆栽两种外源褪黑素施加方式对植物生长发育的影响

2.2 外源褪黑素促进玉米根系发育

我们总共测量了11 个根系参数，并分为3 大类，包括总根，主根和种子根。如表1 所示，玉米根系构型的特征包括根的长度、数量、表面积、体积等。选取了具有代表性的正常条件下和PEG 诱导的干旱条件下的根系扫描图像（图2），施加褪黑素的植株在正常条件和PEG 诱导的干旱条件下根系比未施加的植株更庞大强壮。

对玉米幼苗根系的扫描图像进行统计分析，计算出11 个性状的平均值和标准偏差，并进行ANOVA 分析，统计结果如表2 和表3 所示。正常条件下施加褪黑素的植株根系和对照组有显著性的差异。施加褪黑素的玉米根系在长度，表面积，体积，以及侧根的数目等都显著高于未施加褪黑素的玉米植株。其中差异性最明显的主要表现在主根的长度（PRL），主根的体积（PRV）以及主根上侧根的数目（LRNPR）。相比于未施加褪黑素的植株根系，施加褪黑素的植株根系PRL 提高了37%，PRV 增加了6%，LRNPR增加了15%。PEG6000诱导的干旱条件下，玉米幼苗的根系发育受到的一定的抑制，在根系直接添加褪黑素可以缓解根系发育受到的抑制。其中未施加褪黑素的植株总根长（TRL）下降了29.71%，总根表面积（TSA）下降了42.3%，总根体积（TRV）下降了41.1%。施加褪黑素的植株TRL 只下降了12.1%，TSA 下降了5.8%，TRV 下降了16.8%。

2.3 干旱条件下外源褪黑素的施加减少ROS和MDA的积累

对水培植株的叶片、根系和盆栽植株的叶片采用组织化学染色和分光光度法分析两种主要活性氧（O2-和H2O2）以丙二醛（MDA）的含量。干旱条件下，外源褪黑素的施加能够降低O2-在叶片中的积累（图3-A，3-B）。正常浇水条件下，直接添加褪黑素和种子浸泡褪黑素两种施加方式对植物叶片和根系中H2O2的含量的无明显影响。干旱条件下叶片和根系都表现出明显的H2O2积累，根灌褪黑素和种子浸泡褪黑素两种施加方式都显著减少了H2O2的积累（图3-C，3-D），其中根灌褪黑素幼苗的叶片和根系中H2O2的含量相比未施加褪黑素的植株分别下降了34.3%，36.59%。不同浓度（0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L）褪黑素浸种的幼苗叶片中H2O2的含量分别是4.676 μmol/g、3.196 μmol/g 和3.168 μmol/g。

在正常条件下，采取上述两用方式施加褪黑素对丙二醛含量没有影响，但是干旱条件会导致叶片和根系中MDA 的积累，褪黑素的施加会降低MDA 的含量，减少MDA 的积累（图3-E，3-F）。干旱条件下，根灌褪黑素幼苗的叶片和根系中MDA 的含量相比未施加褪黑素的植株分别下降了38.6%，29.5%。 不 同 浓 度（0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L）褪黑素浸种的幼苗叶片中H2O2的含量分别是2.117 nmol/g、1.451 nmol/g 和1.435 nmol/g。

表1 玉米根系构型构相关特征概述

图2 具有代表性的正常条件下和PEG6000 诱导的干旱条件下的根的扫描图像

表2 正常条件下水培根灌褪黑素对根系构型相关性状影响的统计总结

表3 PEG6000 诱导的干旱胁迫条件下水培添加褪黑素对根系构型相关性状影响的统计总结

2.4 外源褪黑素提高玉米幼苗的相对含水量（RWC）

如图4-A，使用卷纸水培法，在正常条件下，褪黑素的施加对植株叶片的相对含水量没有明显的影响，而在PEG6000 诱导的干旱胁迫条件下，叶片的相对含水量会降低，褪黑素的施加会抑制相对含水量的下降，施加褪黑素的植株相对含水量为85.9%，未施加褪黑素的植株相对含水量为63.6%。同样在盆栽条件下，干旱胁迫8 d 后，经褪黑素处理的植株相对含水量显著高于未处理的植株。未处理植株的相对含水量是46.56%，50 μmol/L 褪黑素处理的植株叶片的相对含水量是50.83%，500 μmol/L褪黑素处理的植株叶片的相对含水量是50.43%（图4-B）。

2.5 干旱条件下外源褪黑素增强玉米的抗氧化系统

测定两种褪黑素施加方法在正常条件下和干旱胁迫条件下对植物抗氧化酶（POD、CAT、SOD）的活性的影响，实验结果表明，在水分充足的条件下，两种外源褪黑素的施加都对抗氧化酶的活性没有明显的影响。PEG6000 诱导的干旱胁迫条件和自然干旱条件会导致抗氧化酶活性的增加，其中根灌褪黑素的植物叶片中SOD、CAT 和POD 活性比未施加褪黑素的植株分别提高了9.34%、14.62%、8.48%，根系中SOD、CAT 和POD 活性分别提高了9.65%、27.21%、10.89%。种子浸泡褪黑素的植株叶片SOD、CAT 和POD 活性同样高于种子未浸泡褪黑素的植株（ 图5），0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L浓度褪黑素处理条件下盆栽植物叶片的SOD 活性为4.348 U/mL、5.4 U/mL、5.39 U/mL、CAT 活性为46.885 U/（mg protein）、54.23 U/（mg protein）、52.39 U/（mg protein），POD 活性为113.85 U/（mg protein）、139.91 U/（mg protein）、138.52 U/（mg protein）。

2.6 干旱条件下外源褪黑素的施加提高玉米幼苗的光合作用

测量气体交换参数，实验结果表明，褪黑素的施加对正常条件下的气体交换参数影响不显著。在干旱胁迫条件下，蒸腾速率、光合速率和气孔导度均显著降低。然而，褪黑素的应用在一定程度上抑制了这种下降。干旱胁迫条件下，褪黑素处理的玉米幼苗叶片气孔导度、蒸腾速率和光合速率均高于未处理的玉米幼苗（图6-A，6-B，6-C）。0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 浓度褪黑素处理的植物叶片气孔导度分别为41.25 mmol/（m2·s）、50.625 mmol/（m2·s）、51.25 mmol/（m2·s），蒸腾速率分别为1.307 mmol/（m2·s）、2.285 mmol/（m2·s）、2.236 mmol/（m2·s），光合速率分别为11.96 μmol/（m2·s）、14.68 μmol/（m2·s）和13.8 μmol/（m2·s）。

测定玉米叶片的叶绿素浓度，实验结果表明，在正常条件下，叶片叶绿素浓度（以SPAD 的形式评估）不受褪黑素施加的影响。经过8 d 的干旱胁迫后，叶绿素浓度明显降低，0 μmol/L、50 μmol/L、500 μmol/L 浓度褪黑素处理的植物叶片叶绿素浓度分别为36.115、45.975 和45.575，即褪黑素处理的幼苗叶绿素浓度高于未处理的幼苗（图6-D）。

对玉米叶片的叶绿素荧光进行测定，实验结果表明，在正常浇水条件下，施加褪黑素对玉米叶片的叶绿素荧光没有显著的影响。在干旱胁迫下，植物叶片的叶绿素荧光会显著下降，0 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L 浓度褪黑素处理的植物叶片叶绿素荧光值分别为0.608、0.671 和0.657，所以经过褪黑素浸种的植株叶绿素荧光的下降得到了明显地抑制（图6-E）。

3 讨论

众所周知，非生物胁迫可以抑制作物的生长、发育和生产。最近的研究表明，一些化合物可以使植物更好地抵抗非生物胁迫。褪黑素是一种新型的植物激素和启动剂，2008 年，Wei 等［23］在拟南芥中发现了第一个植物褪黑素的受体（CAND2/PMTR1），研究发现植物褪黑素通过阻止H2O2和Ca2+信号实现对异源三聚体G 蛋白α 亚单位的调节，与CAND2/PMTR1受体结合，导致气孔关闭。据报道，褪黑素在植物生长和发育的调控中发挥关键作用，且能减轻非生物胁迫引起的氧化损伤［24］。显然，这些生理过程可能通过尚未确定的植物受体/其他结合生物分子进行调控，需要对受体依赖的植物褪黑素信号在其他生理过程中的作用进行深入研究。

图3 水培根灌和浸种盆栽两种褪黑素处理方式对ROS 和MDA 含量的影响

图4 水培根灌和浸种盆栽两种褪黑素处理方式对植株叶片相对含水量的影响

植物通过改变水分利用减少干旱胁迫造成的不良影响。地上部分通过气孔控制蒸腾来减少水分损失，地下部分则不断扩大强壮根系来保持足够的水分吸收。发达的根系是植物营养生长和果实发育的基础。近年来，植物根系已成为国内外许多研究的中心问题。根系的生物量、长度、密度和深度等性状是干旱环境下影响最终产量的主要抗旱性状［25-26］。深的根系有助于从相当深的土壤中提取水分［27］。根是植物适应干旱的重要器官，深的根系使玉米能够获得土壤深处的水分，这被认为是决定玉米抗旱性的重要因素。在许多植物中，褪黑素已被证明能促进根的生长。外源性褪黑素对野生芥菜黄化幼苗的刺激作用表现出浓度依赖性。0.1 mmol/L褪黑素的应用也提高了芥菜根中内源性游离吲哚乙酸的水平［28］。在甜樱桃砧木的实验中也发现了类似的效应，低浓度的褪黑素对砧木的根数和根长有自生反应，而高浓度的褪黑素对所有的砧木都有生根抑制作用［29］。但是这种差别反应的机制仍然未知。Zhou 等［30］研究发现GmDREB1在转基因植物中可以调节褪黑素的合成，增加褪黑素的含量，从而减轻干旱胁迫对根系发育的抑制作用。在本研究中，通过对植株根系形态的对比分析，结果表明外源褪黑素的施加可以促进主根的伸长和增加侧根的数量，增大根系的表面积、体积，使其拥有更丰富的根系。在PEG 诱导的干旱条件下，施加褪黑素能使受到抑制的植株根系生长得到缓解。同时褪黑素的施用减轻了干旱胁迫对玉米幼苗生长的抑制程度。结果表明，褪黑素可能通过调节根系生长提高植物抗旱性，但是具体的机制还需要有进一步的研究。

图5 水培根灌和浸种盆栽两种褪黑素处理方式对玉米植株抗氧化酶活性的影响

图6 褪黑素浸种对气体交换参数，叶绿素含量，叶绿素荧光以及相对含水量的影响

为了减少干旱胁迫诱导的ROS 积累，植物进化了出一系列复杂的酶和非酶防御系统来抵御氧化损伤［31］。植物细胞的抗氧化防御系统包括酶性抗氧化剂（POD、CAT、SOD、APX、GPX、GR 和DHAR）和非酶性抗氧化剂。许多研究发现抗氧化酶活性可以响应渗透胁迫［32］，外源褪黑素可以调节一些抗氧化酶活性来缓解胁迫诱导的植物活性氧的积累［33-34］。先前的研究表明，外源褪黑素可以诱导内源一氧化氮的产生［35］，一氧化氮（NO）已经成为植物中一种重要的信号分子，因此，一氧化氮是褪黑素增强非生物胁迫的耐受性所必需的，其可下调miR398 表达以激活ROS 清除酶活性并促进相关基因的表达并最终清除细胞内ROS［36］。在小麦中，褪黑素处理可清除活性氧积累，并通过刺激抗氧化酶和增加抗氧化剂来减轻铝诱导的脂质和蛋白质的氧化损伤［37］。MzASMT1在拟南芥中的过表达显著降低了活性氧的产生，且植物比野生型植株表现出更好的抗旱能力［38］。同时，植物褪黑素还可以提高细胞器的抗氧化能力，调节C-重复序列结合因子（CBFs）等逆境反应基因的表达，从而提高植物在受到各种非生物逆境胁迫时的抗逆性［39-40］。这些研究都表明，抗氧化酶活性响应渗透胁迫，褪黑素可以调节部分抗氧化酶活性，缓解植物在干旱胁迫下诱导的ROS 的积累［33-34］。在本研究中，直接施加褪黑素和褪黑素浸种两种方法都提高了根系和叶片的抗氧化酶（包括SOD、CAT 和POD）的活性，减少了H2O2和MDA 的积累，这些结果与先前大豆的研究是一致的，褪黑素可以直接清除ROS，还可以促进其他抗氧化剂和抗氧化酶的积累，间接清除ROS，从而调节玉米幼苗细胞的氧化平衡，维持细胞内ROS 浓度，防止活性氧积累，从而减少干旱胁迫对膜脂质过氧化造成的损害，提高玉米幼苗的抗旱性。2019 年Arnao 等［41］提出了一个模型，认为植物褪黑素的作用都与氧化还原网络的不同调节元件（如活性氧ROS 和活性氮RNS）通过H2O2和NO的作用联系在一起。ROS、RNS 和植物褪黑素形成了一个三联体，调节植物体中的氧化还原网络，但是这些元件如何在不同的生理情况下调节氧化还原动态平衡目前还不清楚。

光合作用是植物利用光能驱动有机化合物合成的物理化学过程，是植物生产的基础。干旱是一种严重的抑制光合作用的环境胁迫。通常认为，水分胁迫下光合速率下降的主要原因是由气孔关闭引起的环境CO2扩散到羧化部位的限制。褪黑素可以作为光合作用和气孔导度的增强剂或保护剂，上调光系统、电子转运体和ATP 酶基因的许多元素。褪黑素处理植株表现出净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、光系统II 量子效率和光合电子传递速率的增加。褪黑素还通过调节保卫细胞阴离子通道蛋白和脱水蛋白来优化恶劣条件下的气孔功能，增加气孔张开程度，增加二氧化碳的利用率。在Calvin 循环中，褪黑素调节Rubisco 元件、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和糖酶的表达。此外，ASC-GSH 循环、TCA 循环以及肌醇和脂肪酸生物合成途径的元素也受到褪黑素的调节［42］。已有研究表明，在干旱条件下，褪黑素处理的苹果幼苗保持了显著较高的CO2同化率和气孔导度，与未经处理的苹果相比，褪黑素处理的苹果在干旱胁迫下保持了较高的光合速率［29］。同时干旱胁迫通常会导致叶片中PSII 的损伤［20，43-46］。气孔是植物叶片进行气体交换的主要通道，在光合作用和呼吸作用中起着重要的作用。褪黑素的应用提高了苹果和葡萄的气孔导度［47］。在本研究中，以Fv/Fm的表达为代表的PSII 光合效率在经褪黑素处理的植株中拥有在比未处理植株更高的数值。这些结果表明褪黑素对干旱诱导的光合系统损伤具有保护作用。此外，对气孔导度，光合速率，蒸腾速率进行测定，种子浸泡褪黑素的玉米植株显著高于未处理的的植株，因此褪黑素可能通过提高植物的光合效率提高植物的抗旱性。

褪黑素不仅能够促进植物的萌发、生长和繁殖，还能促进果实的成熟［4］。褪黑素处理可以上调乙烯信号转导相关基因的转录，从而诱导果实成熟和软化，使番茄（Solanum lycopersicumL.）具有更好的色泽和风味［48］。此外，Sun 等［49］蛋白质组学分析表明，褪黑素处理提高了与花青素积累相关的蛋白含量。尽管对褪黑素在调控植物生长发育的分子和代谢机制方面的研究有了很大的进展，但对该领域的研究仍然面临着很多挑战，包括褪黑素的受体以及褪黑素代谢物，它们在调节植物在逆境条件下的各种上下游信号级联中都发挥着明显的功能。

本研究揭示了褪黑素可能通过促进玉米植株的生长发育，促进光合作用抗氧化作用提高植株抗非生物胁迫的能力。之前的研究大多采用根灌褪黑素或者叶面喷洒褪黑素两种方式来提高玉米的抗生物胁迫能力［50-51］。本研究则采用浸种的方式探讨干旱胁迫下外源褪黑素对玉米对抗氧化酶的影响，这些发现为外源性褪黑素在玉米增产中的潜在应用奠定了基础，也为深入研究褪黑素介导的玉米植株抵抗干旱胁迫的分子机制提供了依据。

4 结论

本文主要研究了褪黑素对玉米幼苗根系发育和抗旱性的影响。首先，褪黑素促进根系发育，与对照相比，显著提高了主根和种子根的长度，侧根数量和根系总长度，总表面积，促进植物土壤水分的吸收；其次，褪黑素的施加提高了抗氧化酶（SOD，POD，CAT）的活性，强化了玉米抗氧化系统，从而可以降低干旱诱导的活性氧积累，帮助植物维持较高的PSII 光合效率，增强植物的光合作用，从而提高了植物的抗旱性。褪黑素参与了干旱条件下植物水分状况的调节，在干旱条件下了提高玉米叶片的相对含水量。