兼防黄瓜根腐病和根结线虫病的淡紫拟青霉和哈茨木霉的筛选

张雅静 宋美燕 张怡静 房庆 杨俊 彭德良 黄文坤

彭焕2 朱英波1 孔令安2

（1. 河北科技师范学院 农学与生物科技学院，秦皇岛 066000；2. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3. 中国农业大学 植物保护学院，北京 100193）

根腐病和根结线虫病是蔬菜生产上危害最为严重的两类土传病害，尤其以黄瓜、番茄等葫芦科和茄科蔬菜根部病害更为严重，一般会导致产量损失10%-15%以上，有时可达30%-40%以上，甚至绝收［1-2］。根腐病主要发生在植株的茎基部和根部，在整个生育期均可发病，侵害植株根部维管组织使植株死亡，其中镰孢菌（Fusariumspp.）引发的根腐病尤为常见，据报道尖孢镰孢菌（F.oxysporium）是引起土传病害的优势种群［3］。由根结线虫（Meloidogynespp.）引起的根结线虫病是蔬菜生产尤其是温室大棚蔬菜危害最为严重的根部病害。根结线虫具有种类多、分布范围广、危害程度大、寄主范围多等特点，很难防治［4］。目前，已描述并鉴定的根结线虫多达100 多种，以南方根结线虫（M.incognita）、爪哇根结线虫（M. javanica）、北方根结线虫（M. hapla）和花生根结线虫（M. arenaria）最为常见，其中以南方根结线虫（M. incognita）寄主的种类多，是侵害蔬菜的优势种群［5］。根结线虫侵害植株根部造成伤口，为其他土传病原菌的侵染创造有利条件，加重病害的发生程度，如根结线虫加重镰孢菌侵染寄主植物［6-7］。因此，需重视根结线虫（Meloidogynespp.）的防治，如果能有效的预防控制根结线虫，则可以大大减轻蔬菜根部病害的发病率和发病程度。

目前，蔬菜根部病害的防治，仍以化学防治为主，但由于高毒、高残留、污染环境等诸多弊端，越来越多的化学农药被逐渐限制使用。生防真菌具有对环境、生态和人类健康安全等优点［8］，越来越受到重视，已成为国内外研究的热点方向之一。已报道的生防真菌主要包括：镰孢菌属（Fusariumspp.）、曲霉属（Aspergillusspp.）、淡紫拟青霉（Purpureocillium lilacinum）和木霉菌（Trichodermaspp.）等。其中淡紫拟青霉（P. lilacinum）和木霉菌（Trichodermaspp.）被研究和应用最广泛，因其发酵生产较简单、使用方便且对多种病原物均有抑制作用，是一类非常理想的生防真菌［9-11］。陈小均等［12］研究发现，木霉菌对土壤中的很多病原真菌都有很好的抑制作用，经过木霉菌处理盆栽烟草后能有效防治烟草镰孢菌根腐病害，还具有促生作用。高学彪等［13］报道，淡紫拟青霉对南方根结线虫卵的寄生率达60%-70%，还能产生促进植株生长的物质。

为筛选同时防控根腐病和根结线虫病的淡紫拟青霉和哈茨木霉菌株，本研究从京北5 省（河北、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江）采集茄科、葫芦科蔬菜的根际土壤，从中分离、筛选拮抗根腐病原菌尖孢镰孢菌的拮抗菌株，通过对拮抗菌进行安全性评价，筛选出对黄瓜幼苗没有危害的淡紫拟青霉和哈茨木霉菌株，通过室内盆栽试验，筛选出同时对根腐病和根结线虫病有防效的淡紫拟青霉和哈茨木霉菌株，以期为研发防治蔬菜根部病害的生防制剂提供候选材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样 采自京北5 省（河北、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江）茄科、葫芦科蔬菜的根际土壤，共25 份。

1.1.2 培养基 蛋白胨五氯硝基苯培养基（蛋白胨15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，五氯硝基苯750 mg，琼脂20 g，水1 L），用于土壤稀释悬浮液的涂布［14］。马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA），用于菌株培养及分离菌株与病原菌的对峙培养。马铃薯液体培养基（PSB），用于菌株发酵液的摇培。

1.1.3 供试菌株和药剂 根腐病原菌尖孢镰孢菌，用于测试分离菌株的拮抗性和盆栽防效测试，哈茨木霉菌剂、淡紫拟青霉菌剂和氟吡菌酰胺杀线剂，用于盆栽防效测试的对照，按照说明书推荐剂量使用。

1.1.4 供试幼苗和病土 黄瓜种子（中农18 号），26℃培养箱培育15-20 d，用于安全性评价。根结线虫病土采于河北省中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地温室大棚。

1.2 方法

1.2.1 生防真菌的分离 土样采集采取5 点取样法，用土壤擦拭的小铲采集蔬菜根部附近 2 mm 内附着的土壤，每份土样充分混合装进无菌自封袋中，4℃冰箱保存［15］。

真菌分离参考房庆方法［16］。称取土样10 g，倒入三角瓶（500 mL）中，加入灭菌水90 mL，玻璃棒充分搅拌，稀释到400 倍悬浮液进行涂布，置于26℃培养箱中培养，待菌落长出，及时挑菌到PSA平板，26℃培养箱中培养。

1.2.2 拮抗菌株的筛选 将分离纯化的菌株与病原菌尖孢镰孢菌菌株对峙培养，26℃培养箱培养，第3 天开始观察候选菌株对病原菌菌株是否具有拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌株的分子鉴定

1.2.3.1 基因组DNA 的提取 参考CTAB 法［17］。收集20 mg 新鲜菌丝至2 mL 离心管中，加入650 μL 2% CTAB，液氮速冻后充分研磨样品，65℃水浴30 min；12 000-13 000 r/min 离心10 min，吸取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），混匀，12 000-13 000 r/min 离心10 min；吸取350 μL 上清，加入700 μL（两倍体积）无水乙醇，12 000-13 000 r/min 离心5 min；弃上清，沉淀用75%酒精洗涤2次，充分晾干；加入100 μL 灭菌水，待沉淀溶解，4℃备用。

1.2.3.2 引物及PCR 扩增 本研究所用的通用引物为ITS1/4［18］，引物序列分别为（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR 扩增反应体系（50 μL）：10×Buffer 5 μL、2.5 mol/L dNTP 4 μL、正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板2 μL，用灭菌水补足至50 μL。试剂均购自TaKaRa 公司。PCR 反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测：PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察DNA 条带片段大小。

1.2.3.3 样品测序 使用DNA 回收试剂盒对PCR 产物进行回收纯化（天根，DP209）；回收产物送中国农业科学院作物科学研究所进行测序，测序结果登陆NCBI 进行BLAST 分析。

1.2.3.4 基于ITS 序列构建系统进化树 根据测序结果，使用MEGA 6.0 软件进行比对，除去比对结果中两端长度不一致的序列，采用邻接法（Neighbor-Joining tree）构建系统进化树，重复取样1 000 次进行自展值分析来评估系统进化树的拓扑结构的稳定性［19］。

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1.2.4 拮抗菌株对黄瓜幼苗的安全性评价 用打孔器从菌落边缘打孔，将菌落块接种于装有60 mL PDB 培养基的三角瓶（250 mL）中，150 r/min，26℃摇培5 d，用双层纱布过滤，收集滤液，用无菌水将分生孢子浓度调至约1×107CFU/mL［20］。待黄瓜幼苗长出两片真叶，从穴盘中整株挖出并将根部清洗干净，选取健康、大小均匀的幼苗，用剪刀减掉主根2-3 cm，浸泡在发酵液中，以清水处理作为对照，26℃培养箱中培养，接种5 d 后观察黄瓜幼苗长势情况并拍照［21］。

1.2.5 根腐病的防效测试 黄瓜幼苗生长至两片真叶，浇灌供试菌株发酵液100 mL，48 h 后浇灌根腐病病原菌尖孢镰孢菌发酵液50 mL。设置7 个处理：只接清水对照组；只接病原菌尖孢镰孢菌对照组；病原菌+哈茨木霉菌剂和病原菌+淡紫拟青霉菌剂对照组；病原菌+淡紫拟青霉试验组和病原菌+哈茨木霉试验组（2 组），每个处理设置6 个重复，试验重复3 次。28℃培养箱培育，正常管理，30 d 后调查黄瓜幼苗发病情况，计算防治效果，拍照。评价标准［22］：0 级，无症状；1 级，1 片叶萎蔫；2 级，2-3 片叶萎蔫；3 级，整株萎蔫；4 级，植株死亡。

发病率（%）=发病株数/（发病株数+健康株数）×100%

防治效果（%）=（对照组发病率-试验组发病率）/对照组发病率×100%

1.2.6 安全菌株对根结线虫病的防效测试 黄瓜种子播种在含有根结线虫的病土中，待黄瓜幼苗生长至两片真叶时，在黄瓜茎基部周围2 cm 内用灭菌枪头均匀钻取5 个直径为1 cm 的小孔，滴灌6 mL 发酵液/孔，共浇灌30 mL 发酵液/盆（苗）。分别以灌入等量的清水和药剂作为对照，每个处理设置6个重复，试验重复3 次。

根结指数=∑（各级病株数×相应级别数）（/调查总株数×最高级值）

防治效果=（对照根结指数—处理根结指数）/对照根结指数×100%

2 结果

2.1 根际土壤拮抗真菌的筛选

从京北5 省（河北、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江）采集茄科、葫芦科蔬菜的根际土样25 份，从中分离共获得真菌699 株。其中河北2 份土样，筛选出115 株；内蒙古6 份土样，筛选出177 株；辽宁9 份土样，筛选出220 株；黑龙江7 份土样，筛选出135 株；吉林1 份土样，筛选出52 株。各省份的采集样品及其菌株分离信息见（表1）。

表1 土样采集信息及真菌分离数量

通过与根腐病病原菌尖孢镰孢菌菌株对峙培养，筛选出拮抗真菌89 株（表2），拮抗菌株明显抑制根腐病菌尖孢镰孢菌的菌落生长，导致其菌落出现不同程度的生长停滞甚至萎缩现象（图1）。

2.2 拮抗致病性尖孢镰孢菌的淡紫拟青霉和哈茨木霉的筛选

使用真菌通用引物ITS 1/ITS 4 进行PCR 扩增并测序，对89 株拮抗菌株进行初步鉴定，测序结果见（表2），筛选出淡紫拟青霉3 株（2018-31、2018-32 和2018-79）和哈茨木霉2 株（2018-44 和2018-54），鉴定到的主要菌属有：镰孢菌属43 株，曲霉属14 株，被孢霉属（Mortierellaspp.）11 株等，结果表明，拮抗菌株优势种群为镰孢菌（Fusariumspp.）。

基于ITS 序列的系统发育分析结果（图2）表明，亲缘关系相近的菌株聚在一支，其中哈茨木霉2018-44 和2018-54 聚在一起，在3 株淡紫拟青霉中，2018-31 和2018-79 聚在一起，亲缘关系更近，优势种群尖孢镰孢菌整体上聚为1 支，但明显分为3 个分支，表明其具有一定的遗传差异。

2.3 拮抗淡紫拟青霉和哈茨木霉对黄瓜幼苗的安全性评价

通过安全性评价，发现2 株哈茨木霉（2018-44和2018-54）和1 株淡紫拟青霉（2018-32）对黄瓜幼苗表现为安全，对黄瓜幼苗没有危害性，其发酵液浸泡的黄瓜幼苗与清水对照相似，黄瓜幼苗长势健壮，叶片未出现黄化萎蔫现象（图3）。另外2 株淡紫拟青霉（2018-31 和2018-79）的发酵液对黄瓜幼苗表现不同程度的致病力，黄瓜幼苗长势稍差，叶片稍微萎蔫，叶片边缘或者中部有典型病斑，登记“黄化萎蔫”型，而对照致病性尖孢镰孢菌菌株的发酵液使黄瓜幼苗出现明显的萎蔫干枯现象，登记为“干枯”型（图3）。

图1 拮抗真菌对致病性尖孢镰孢菌的拮抗效果

2.4 淡紫拟青霉和哈茨木霉安全菌株对黄瓜根腐病的防效

通过盆栽试验测试，发现2018-32 号淡紫拟青霉和2018-44 号哈茨木霉发酵液灌根的黄瓜幼苗与清水对照、淡紫拟青霉菌剂和哈茨木霉菌剂相似，黄瓜幼苗长势健壮，未出现黄化萎蔫干枯现象（图4），对根腐病的防效分别为81.19%和73.08%，明显高于同类商品菌剂。2018-32 号淡紫拟青霉处理黄瓜幼苗的株高、根长、茎叶鲜重和根鲜重分别为20.50 cm、16.50 cm、6.63 cm 和1.53 cm，与同类商品菌剂处理的效果相当（表3）。而2018-54 号哈茨木霉发酵液灌根的黄瓜幼苗出现了黄化萎蔫干枯现象，与只接病原菌尖孢镰孢菌对照相似（图4），表明该菌株对根腐病没有防治效果。

2.5 淡紫拟青霉和哈茨木霉安全菌株对黄瓜根结线虫的防效

研究结果发现，2018-32 号淡紫拟青霉和2018-44 号哈茨木霉发酵液灌根后的黄瓜根系虽有根结，但数量不多，根结数与对照商品菌剂相差不明显（图5），其防治效果分别为64.06%和50.54%，高于同类商品菌剂，且有显著差异，但尚未达到杀线虫剂氟吡菌酰胺的防效。其中2018-32 号淡紫拟青霉处理的黄瓜幼苗的株高、根长、茎叶鲜重值均为最大，分别为56.25 cm、7.5 cm 和17.57 cm（表4）。清水对照的黄瓜根系受害最严重，主根、侧根根结多，根系变粗且畸形；氟吡菌酰胺杀线剂的根结数最少，且根结小没有变粗畸形等症状（图5）。

3 讨论

拮抗菌具有防治其拮抗靶标病原物引起病害的潜力。分离防治根腐病的生防真菌，一般是从筛选、鉴定拮抗真菌菌株开始的。拮抗菌可能通过竞争病原菌生长所需的营养和空间，也可能重寄生病原菌，吸收其营养导致病原菌营养不良，也可能是产生抑制病原菌生长的次生代谢产物、几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶等降解酶类［24］。候选菌株对病原菌的拮抗效果可能受多因素的制约，如培养基配方、接种方式、病原菌类型和环境条件等［25］。本研究结果发现镰孢菌的拮抗数量最多，占拮抗菌的52.44%，是拮抗菌的优势群体，可能与本研究使用的五氯硝基苯培养基有关，镰孢菌对低浓度的五氯硝基苯具有天然的抗药性，使用含有五氯硝基苯的筛选培养基倾向性的增加了镰孢菌的分离频率。

表2 拮抗菌株分子鉴定及其安全性评价

表2 续表

本研究筛选获得了3 株淡紫拟青霉和2 株哈茨木霉拮抗菌株。除此之外，本研究还发现木贼镰孢

菌（F. equiseti）、毛壳霉菌（C. piluliferum）、茄病镰孢菌（F. solani）和被孢霉属（Mortierella spp.）等菌株的发酵液对黄瓜幼苗表现为安全、不致病。在拮抗菌的基础上，筛选出对黄瓜幼苗安全的菌株数量可能与多种因素相关，如黄瓜幼苗自身长势的差异、菌株的发酵产物和产物活性的差异，菌株产生的分泌物和毒素的差异，发酵液pH 值的改变等，均能导致菌株发酵液对黄瓜幼苗的致病力出现强弱差异［26］，影响安全性评价结果。

图2 基于ITS 序列的系统发育进化树

图5 不同菌株发酵液对黄瓜根结线虫的影响

图4 不同菌株发酵液对黄瓜根腐病的影响

图3 拮抗菌株发酵液对黄瓜幼苗的安全性测试

表3 不同菌株发酵液对黄瓜长势及根腐病的防效

表4 不同菌株发酵液对黄瓜长势及根结线虫病的防效

本研究筛选获得对黄瓜根腐病和根结线虫病具有良好防效的淡紫拟青霉（2018-32）和哈茨木霉（2018-44）菌株，在防病和促进作物生长方面与相关报道结果一致。Harman 等［27］发现哈茨木霉（T.harzianum）能促进植株生长，改善植物营养状况。贺字典等［28］发现哈茨木霉对镰孢菌引起的黄瓜根腐病防治效果为100%。刘云龙等［29］用哈茨木霉制剂处理土壤后栽培辣椒，对辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和尖孢镰孢菌（F. oxysporum）引起的根腐病具有一定的防病作用，还能促进辣椒的生长，提前开花、挂果，并提高产量。在20 世纪90 年代，刘杏忠等研究发现淡紫拟青霉防治根结线虫，可能通过淡紫拟青霉产生的激素促进植株的生长发育，提高植株的抵抗力和产量［30］。史怀［31］等筛选到一株能促进植物生长的淡紫拟青霉菌株，其分泌的胞外多糖对尖孢镰孢菌的孢子萌发、菌丝体生长具有明显抑制作用。研究发现哈茨木霉菌株能够降低植株根结数量，对根结线虫有较好的生防作用，还能促进植株生长［32］。与报道的生防菌株多防治单一土传病害不同，本研究中筛选获得的淡紫拟青霉（2018-32）和哈茨木霉（2018-44）同时对黄瓜根腐病和根结线虫病均有显著防效，且其防效高于同类商品菌株，为研发防治蔬菜根部病害的生防制剂提供珍贵的候选材料。

4 结论

从京北5 省（河北、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江）采集茄科、葫芦科蔬菜根际土样，从中分离、筛选获得89 株拮抗根腐病病原菌尖孢镰孢菌的拮抗真菌，通过ITS1/ITS4 扩增测序筛选获得了3 株淡紫拟青霉和2 株哈茨木霉拮抗菌株；采用菌株发酵液泡根方法评价对寄主的安全性，明确了2 株哈茨木霉（2018-44 和2018-54）和1 株淡紫拟青霉（2018-32）对黄瓜幼苗安全无致病性。通过盆栽试验测试进一步验证其对根腐病和根结线虫病的防效发现，2018-32 号淡紫拟青霉和2018-44 号哈茨木霉对根腐病和根结线虫病同时具有良好的防效，对根腐病的防效分别为81.19%和73.08%，对根结线虫病的防效分别为64.06%和50.54%，其防效均好于同类商品菌剂。

致谢

本研究所用测试拮抗性的致病性尖孢镰孢菌（F.oxysporum）菌株由中国农科院蔬菜花卉研究所茆振川老师提供，特此表示感谢。