负载西罗莫司水凝胶复合补片在腹腔镜腹壁修复中的应用

熊波 张志刚 嵇振岭 胡琬君

腹壁疝是由各种原因导致的腹壁筋膜或肌肉薄弱或缺失，在腹内压的作用下导致内脏向外膨出，形成腹外疝。临床采用外科手术进行治疗。基于假体补片的无张力修补术应用越趋广泛[1-2]，疝修补假体材料主要是聚丙烯材料[3-4]，但其较强的组织刺激和异物反应会导致脏器粘连，致使聚丙烯补片无法直接用于腹膜内疝的修补。西罗莫司(Sirolimus,SRL)是一种大环内脂类免疫抑制药物，具有免疫抑制、抗炎、抗纤维化、抗增殖和抗血管生成作用[5]，广泛应用于器官移植和自身免疫性疾病[6]。水凝胶以其优良的生物相容性，在药物释控等方面得到了广泛应用[7]，但水凝胶的高度亲水表面使得其在液体环境中很难定置于组织表面。本研究利用醛基与氨基的反应制备一种具有组织黏附性能的可注射水凝胶，将氧化羧甲基纤维素(oxidized carboxymethyl cellulose,OCMC)与羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)注射混合，将免疫抑制剂SRL包封进凝胶前体溶液中，短时间内原位形成负载SRL的可注射凝胶，采用在腹腔镜经腹腹腔内补片植入术(intraperitoneal onlay mesh,IPOM)对实验猪进行腹膜下补片植入，比较凝胶与普通PP补片整合形成SRL/gel/PP补片及SRL/gel/PP补片与腹壁组织整合。

材料与方法

一、实验动物与材料：普通级健康实验仔猪9只[SCXK(苏) 2016-0009]，性别随机，体重20～25 kg，由江苏亚东实验动物研究院有限公司提供。实验猪随机分为PP组、SRL/gel/PP组和PROCEED组，3只/组。实验经东南大学实验动物保护和使用委员会批准。动物均得到福利对待。实验材料：聚丙烯补片(Bard，US，由东南大学附属中大医院提供)；羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)，高碘酸钠和SRL，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)，购自上海麦克林生化科技有限公司。

二、方法

1.OCMC的制备与表征：取2 g羧甲基纤维素钠溶解于100 ml水，取1.76 g高碘酸钠溶于10 ml水加入上述溶液，避光搅拌6小时，加入1 ml乙二醇，搅拌1小时，终止反应，得到氧化羧甲基纤维素初产物。将初产物注入透析袋(MWCO=3 500 Da)，透析3天，冷冻干燥，得OCMC。利用傅里叶变换红外光谱仪测试CMC和OCMC红外光谱，确定产物的特征化学基团。

a:PP组;b:SRL/gel/PP组;c:PROCEED®组

2.SRL/gel的形成：分别配制5%OCMC和3%CMCS/SRL溶液，按体积比1∶1混合，以倒置法测定凝胶形成时间。

3.SRL/gel/PP复合补片的体外制备：分别配制5%OCMC和3%CMCS/SRL溶液，按体积比1∶1混合，注射到聚丙烯补片表面，得到水凝胶复合补片。

4.手术实施：实验猪禁饮禁食24小时。3%戊巴比妥钠注射液腹腔注射联合肌肉注射陆眠宁0.5 ml。气管插管，皮球辅助呼吸，耳缘静脉滴注氯化钠注射液，以指脉压血氧检测仪监测生命体征。腹腔镜的手术实施采用“三孔法”进行，在腹部倒数第三乳头处切口，约1 cm，插气腹针，打开CO2与气腹机，建气腹，气腹机压力12 mmHg，建立腹腔镜、气腹通路。另2个套管插入腹腔，建立手术通路。用可吸收缝线将PP补片固定于腹壁。将7.5 mlOCMC和7.5 ml CMCS/SRL前体溶液通过双筒注射器混合并注射涂覆于补片表面，构建组合式载药凝胶补片，为SRL/gel/PP组。用同样的方式将普通PP补片和PROCEED®补片进行腹膜下定置，为对照组。见图1。

5.不同防粘连材料体内粘连程度的评价：标准饲喂1年，麻醉，切开皮肤与肌肉层，插入气腹针，建立腹腔镜、气腹通路，观察补片植入部位。按文献方法评价采用双盲的方式对猪的腹腔粘连[8]。将修补处的腹壁组织、粘连部分连同补片一并取下，多聚甲醛固定，行病理学检查。

6.组织病理学检查：HE染色组织学观察腹腔内补片表面粘连情况，补片周围的炎症反应程度；Masson染色分析胶原分布；免疫组化评估补片单丝周围组织肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α) 和白细胞介素(interleukin-6,IL-6)表达情况。

三、统计学分析

应用PASW Statistics 18.0进行单因素方差分析，黏附分数采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.凝胶的理化性质：红外分析表明氧化后的CMC在1 735 cm-1处出现明显的吸收峰，归属-CHO的羰基伸缩振动，经过高碘酸钠的氧化将多糖主链上的邻位羟基断裂形成两个醛基。1 598 cm-1处的羧基特征峰在CMC氧化前后依然存在，未受影响。通过1H-NMR分析发现，经过氧化后的CMC在5.0 ppm处有细微变化，主要是由醛基的形成导致的。通过高碘酸钠氧化CMC可制得OCMC。在将两种前体溶液按照体积比1∶1进行混合后倒置，随时间的延长瓶内混合液体可以逐渐形成凝胶，约40秒后完全形成凝胶，凝胶前体溶液在经过注射器针头混合后依然可以形成凝胶。在注射到补片上后，凝胶可以有效定置在PP补片上，且与补片整合良好。

a:PP组;b:SRL/gel/PP组;c:PROCEED®组

a,d:PP组;b,e:SRL/gel/PP组;c,f:PROCEED®组

2.动物体内试验及粘连评估：PP组补片发生了严重的粘连，无法通过钝器松解，SRL/gel/PP组没有脏器粘连，仅在补片边缘及少量区域出现少量组织增生，且表面被间皮层所覆盖，PROCEED®组依然存在着一定程度的粘连。见图2和表1。

表1 各组补片发生粘连的面积及强度评估(分)

从表1的定量评价我们可以看到，PP组无论在粘连面积还是在粘连强度都显著的高于其余2组。SRL/gel/PP组通过评价仅发现非常少量的粘连，且粘连强度和面积都很小，粘连面积仅为PP组的1/6，通过剥离评估，粘连强度仅为PP组的1/9。同样，PROCEED®对照组也具有较小的粘连强度和面积，虽然SRL/gel/PP组和PROCEED®对照组在组间没有显著差异，但是和PP组的对比可以表明，所制备的SRL/gel/PP补片具有优良的防粘连性能。

3.组织病理学检查：PP补片和PROCEED®植入后，补片单丝周围存在一定的炎性反应，SRL/gel/PP组的炎性反应明显减小。与PP组比较，间皮层厚度明显减小，丰富的血管渗透其间，SRL/gel/PP补片单丝周围的胶原沉积显著小于PP补片和PROCEED®补片，且补片很好的被间皮层覆盖。PP补片和PROCEED®补片周围存在大量的胶原沉积。见图3。

4.免疫组化炎性分析：PP组单丝周围有大量的IL-6表达，PROCEED®组单丝周围的IL-6表达显著减少， SRL/gel/PP补片单丝周围的IL-6仅有轻微的表达。SRL/gel/PP补片组的TNF-α的表达最低。PP组出现严重的炎症反应，PROCEED®组的炎症表达较轻。见图4。

a,d:PP组;b,e:SRL/gel/PP组;c,f:PROCEED®组

通过利用Image J 对不同补片组的单丝周围组织进行半定量分析可以发现，在炎症反应方面，SRL/gel/PP组的IL-6和TNF-α的表达量显著小于PP组，分别仅为PP组的1/5和1/6，见表2。

表2 补片单丝周围组织IL-6和TNF-α表达量的半定量分析

讨论

聚丙烯补片是腹壁重建的常用材料之一，但植入后对周围组织较强的刺激，导致异物反应，引起炎性反应，导致粘连。Diamond等[9]利用透明质酸溶液有效地减小了发生粘连的面积，但液体防粘连剂多为天然高分子或其衍生物，在腹腔液的存在下会很快被稀释，且其流动性决定了它将无法有效覆盖需要防治的区域，加之体内复杂环境条件下，液体防粘连剂很快被机体代谢，无法达到预期的粘连防治周期。固体薄膜是一种很好的防粘连屏障，Seprafilm®作为一种防粘连屏障膜已广泛用于临床，但是由于其质地较脆，容易破裂，且润湿后容易与手术器械黏附[10-11]，因此会在操作上带来了不必要的麻烦。

水凝胶化学成分和机械性质与细胞外基质相似。水凝胶模拟细胞外基质不仅可以防止受损组织之间的直接接触，还可以抑制胶原蛋白和其他免疫反应的过度沉积，消除异物反应并最小化或避免过度纤维化。Zhang等[12]开发了一种可生物降解和热可逆的半乳糖修饰的木葡聚糖水凝胶，用于预防术后腹膜粘连。结果表明，木葡聚糖水凝胶(4%，w/v)可有效预防术后腹膜粘连。水凝胶屏障由于其高度亲水的表面难以黏附到组织上，导致其从潜在粘连部位移位而不能有效预防粘连发生。

我们的研究采用儿茶酚胺制备了具有自固定、可注射、可降解性能的防粘连水凝胶。凝胶在补片表面可以有效形成自固定不易移位的凝胶覆盖体，通过腹腔镜鞘卡通道完成操作，达到凝胶在粘连防治目标位点的全覆盖，有效阻隔补片与脏器直接接触。采用腹腔镜技术对实验猪实施了腹腔内补片植入术，术后1年观察术后部位，与PP组相比，凝胶组补片具有优良的防粘连性能，且补片与腹壁整合良好，未发生皱缩与位移。病理研究显示，SRL/gel/PP组补片表面覆盖着一层较薄的间皮层，与水凝胶优异的组织相容性，抑制了瘢痕组织的异常增生相关。切片未显示水凝胶在补片周围残留，可见凝胶可以完全被生物体降解。补片单丝周围胶原沉积染色显示，三种补片的骨架均为聚丙烯单丝，SRL/gel/PP组补片单丝周围的胶原沉积显著少于PP组与PROCEED®组，水凝胶亲水表面有效防止胶原聚集。进一步对补片周围组织的炎性因子表达的情况分析发现，SRL/gel/PP补片组炎性因子表达明显降低，由于水凝胶优良的细胞与组织相容性极大地降低了机体的异物反应，负载SRL也能够很好地抑制机体过度的免疫反应，从而与水凝胶具有协同作用，抑制胶原沉积[13]。PROCEED®组由于其成分中的氧化再生纤维素会与损伤部位的出血位点形成血栓，导致炎性反应，病理染色和免疫组化的结果中得到了证实。

本研究采用IPOM术式对实验猪直接植入普通聚丙烯补片并在其上涂覆具有自固定、可降解的负载SRL的水凝胶，形成复合式的水凝胶防粘连聚丙烯补片。该复合补片制备及操作简便，粘连防治效果显著，组织相容性优良。