同步分离培养大鼠肝星状细胞和枯否细胞的方法研究

陈峰杰

河南护理职业学院，河南 安阳 455000

肝星状细胞与枯否细胞作为肝内重要的非实质性细胞，也是肝纤维化的主要效应细胞，有促进肝纤维化进程的作用。活化的HSCs是肝纤维化发生的关键细胞和核心环节[1]，可转化为肌成纤维细胞并分泌多种受体，生成大量细胞外基质，促进肝纤维化进程。KCs 可通过分泌的多种细胞因子，促使HSCs活化，参与肝纤维化过程。由于体内环节复杂多变，容易受神经、体液等多因素的影响，体外提取培养原代HSCs与KCs就显得尤为重要。现实中HSCs仅仅占肝非实质细胞总数20～30%[2]，KCs仅占25～40%[3]，KCs和HSCs的形态、密度与其它肝非实质细胞非常接近，一直以来同步提取大鼠原代KCs和HSCs较难。自1982年Knook[4]报道提取肝星状细胞方法后，国内相继报道了多种改良的分离与提取方法[5-8]，但多数报道中的提取方法为单一细胞的分离培养[9-10]，多数方法存在分离过程繁琐，成本高，细胞得率与纯度低等问题。因此，建立简便经济的大鼠原代HSCs与KCs同步分离培养方法，是研究HSCs活化、肝纤维化发生机制的前提与基础性工作。

1 材 料

1.1实验动物 SD大鼠，清洁级，体重400-450g，购自山西医科大学动物中心，普通饲料喂养。

1.2主要试剂 链酶蛋白酶、a-SMA抗体购自Sigma公司；Ⅳ型胶原酶购自Invitrogen公司；DNA酶购自北京索莱宝公司；Nycodenz购自Axis-Shield Pocoslo公司；DMEM培养基购自Gibco公司；RPMI1640购自美国HyClone公司；胎牛血清购自杭州四季青；Desmin抗体、武汉博士德公司的SABC免疫组织细胞化学试剂盒。

1.3主要仪器 Milli-Q Biocel超纯水系统、Jouan IGO-150 CO2培养箱、生物倒置显微镜。

2 方 法

2.1大鼠门静脉插管，链酶蛋白酶及胶原酶液原位灌注 SD大鼠，禁食12h后乙醚吸入麻醉，固定大鼠并用碘伏消毒腹部皮肤，呈“U”型剪开腹部，充分暴露肝脏、肝门静脉，肝门静脉插管并牢固固定导管，39℃前灌注液，20mL/min，灌注12-15min，剪开大鼠下腔静脉，灌注的同时按摩灌注不良处，肝脏变白时游离肝脏。40℃链酶蛋白酶，5mL/min，灌注 25min，之后灌注37℃Ⅳ型胶原蛋白酶液，10mL/min，30min。

2.2密度梯度离心，制备混合细胞悬液 将循环灌注后的肝脏，移入超净工作台，去除表面被膜，加4mL DNA酶液和振荡液，200-250次/min，37℃摇床恒温振荡30min。加入20mLDMEM液，过滤细胞悬液并收集上清液，10-15℃，1700r /min，离心5min。洗涤3次的细胞悬液中加入DMEM液，沿管底依次缓慢加入10.387%Nycodenz和18.8%的Nycodenz密度梯度液，10℃，20000r/min，离心25min。离心后可见在同一离心管中，因密度不同，原先的细胞悬液中出现明显分层，HSCs与KCs位于细胞悬液的不同层面。

2.3HSCs与KCs同步分离纯化 依据细胞分层情况，平头针依次吸取位于不同层面的HSCs与KCs。DMEM 10-15℃，2000 r/min，5min离心洗涤HSCs三次，20%胎牛血清DMEM悬浮HSCs，用RPMI 1640 10-15℃，2000 r/min，5min离心洗涤KCs三次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640悬浮KCs。

2.4台盼兰拒染实验判定细胞得率与活率 取10μL细胞悬液与10μL台盼兰充分重复吹打混匀，取10ul加到计数板凹槽，镜下计数活细胞，台盼兰着色者为死细胞，未着色者为活细胞，计算细胞得率和活率。细胞悬液标本测定2次，取两次均值。

2.5细胞培养 刚分离的HSCs与KCs分别按2.5×105/mL、1×106/mL密度接种，每孔加1mL细胞悬液，37℃、5% CO2培养箱培养。6h后吸弃KCs培养基，换成10%胎牛血清RPMI 1640培养液。48h后吸弃HSCs培养基，换含10%胎牛血清的DMEM培养液，每2-3d更换一次HSCs与KCs的培养液。

2.6细胞鉴定 使用Desmin及a-SMA抗体免疫细胞化学法鉴定原代培养7d的HSCs，SABC法免疫细胞化学染色。原代培养48h的KCs印度墨汁吞噬实验验证细胞吞噬能力，免疫细胞化学法鉴定KCs内溶菌酶表达情况。

3 结 果

3.1细胞形态观察 镜下可见，刚分离的HSCs可呈圆形、椭圆形，胞质内富含脂滴，折光性强，。24h后多数的HSCs贴壁。48h后少数HSCs伸出伪足，呈星形或多边形。培养5d后的HSCs呈星形，细胞相互融合成片状。7d 后HSCs内脂滴消失，多数细胞呈星形，部分融合呈片状。培养14d 的HSCs，细胞完全伸展，呈现典型的成纤维细胞形态，胞质内有细胞骨架。新分离的KCs呈圆球形，大小均匀一致。4-6h后呈扁圆形，大部分细胞贴壁，少量伸出突起。24h后的KCs体积增大明显，外观呈圆形、三角形或星形。48h后KCs胞质内出现大量脂滴，核呈肾形。72h的KCs开始伸出伪足。培养7d的KCs完全伸展，甚至呈梭形。

3.2免疫细胞化学法鉴定所得细胞 a-SMA与Desmin免疫细胞化学染色后，可观察到HSCs的胞浆呈棕黄色(见图1)。溶菌酶免疫细胞化学染色后的KCs呈阳性，胞质内沉积的棕黄色颗粒清晰可见(见图2)，表明本实验成功同步分离培养了HSCs与KCs。静止期与活化的肝星状细胞均表达Desmin，仅活化的HSCs表达a-SMA。

3.3墨汁吞噬实验来鉴定KCs吞噬能力 KCs以RPMI1640培养48h后，用少量印度墨汁加入KCs进行吞噬实验验证KCs吞噬能力。镜下可见，KCs体积增大，胞质内大量碳素墨汁颗粒围绕在细胞核周围，表明分离培养的细胞KCs具有吞噬活性。

4 讨 论

本实验使用酶原位灌注消化和密度梯度离心相结合的两步法。通过离体灌流链霉蛋白酶去除肝脏实质性细胞即肝细胞、Ⅳ型胶原酶去除胶原纤维，提高细胞得率和纯度。HSCs与KCs密度有一定交叉，密度梯度离心液的选取和配置尤为关键。经过对比，本实验使用的密度分离介质为 Nycodenz，具有性质稳定，配制简单、价格适中的优势。10.387%与18.8%Nycodenz密度梯度离心后HSCs与KCs位于细胞悬液不同层次，细胞分离界面清晰，通过一次实验即可同步分离上述两种原代细胞。而且提取的原代细胞与体内差异较小，可以很大程度反映细胞在体状态。

本实验所建立的HSCs和KCs同步分离培养方法，简便经济，又无需特殊设备和昂贵试剂，分离培养的原代HSCs与KCs生物学性状良好，细胞得率、活率和纯度高，达到后续实验要求。该方法对于研究HSCs、KCs的生物学行为，KCs分泌细胞因子对于HSCs的作用及肝纤维化机制的研究奠定了细胞学基础，值得推广和广泛使用。

图1 培养7天的HSCs desmin免疫细胞染色(DAB显色，×400)

图2 KCs培养48h后溶菌酶免疫细胞化学(DAB显色，×400)