坎地沙坦靶向TRAIL-DR5介导的AMPK信号通路减少宫颈癌细胞自噬保护的研究

齐广涛，张丽丽，郭庆枝，王 莉，李 丽

近几年宫颈癌发病率居高不下，并呈年轻化趋势，患者复发率高，预后不佳。自噬与癌症进展相关，能诱导细胞凋亡，也能实现细胞器更新和代谢需求，进而保护细胞。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase，AMPK)激活可调节细胞增殖、凋亡、氧化应激，是细胞自噬途径的上游通路。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体-死亡受体5(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand-deathreceptor5，TRAIL-DR5)是与自噬相关的跨膜受体，能上调DR5水平进而促进癌细胞凋亡。坎地沙坦是血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受体拮抗剂，临床常用于降血压、改善心肌重塑，在肿瘤增殖、侵袭、血管生成方面也发挥重要作用，可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，但作用机制未知。该研究测定经坎地沙坦作用后的HeLa细胞中自噬相关因子水平，以探究坎地沙坦调控HeLa细胞自噬保护作用相关机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

坎地沙坦购自上海阿拉丁试剂有限公司，货号：C129234-1 g；兔抗人TRAIL-DR5、兔抗人AMPK、兔抗人AMPK磷酸化(p-AMPK)、兔抗人自噬相关基因4A(autophagy related gene4A，ATG4A)、兔抗人微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)、兔抗人Bax、兔抗人Bcl-2、兔抗人β-actin、兔抗人p62一抗均购自上海熹垣生物科技有限公司，货号分别为：XY-R30939、XY-70R-35353、XY-70R-7162、XY-SPC-626D-STR、XY-70R-21593、XY-70R-33866、XY-PSC-70-567-R050、XY-CVL-PAB72987、XY-F48757；羊抗兔IgG-HRP二抗购自上海恒斐生物科技有限公司，货号：SE134；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司，货号：KA3805；iBright FL1500智能成像系统、Attune NxT流式细胞仪购自美国赛飞世尔科技公司。

1.2 细胞

人宫颈癌细胞株HeLa购自中科院上海细胞库。5%CO、37 ℃、98%相对湿度的恒温培养箱中培养，培养液为含有10%FBS的DMEM培养基。隔天换液，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 CCK-8法测定坎地沙坦对HeLa细胞增殖的抑制作用

收集对数生长期HeLa细胞，用DMEM培养基调整细胞密度，HeLa细胞按照8×10个/孔的数量接种至96孔板中。继续常规培养过夜，弃去旧DMEM培养基，加入200 μl含有不同浓度坎地沙坦(坎地沙坦终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)的DMEM培养基，培养48 h后，弃去旧DMEM培养基，各孔加入20 μl CCK-8溶液和不含FBS的180 μl DMEM培养基，2 h后弃培养基，用酶标仪测定450 nm波长处吸光度(optical density, OD)值，同时设置0.1%的DMSO对照组和空白对照组，每个浓度设置6个复孔。细胞增殖抑制率(%)=[1-(OD-OD)/(OD-OD)]×100%。用SPSS软件计算坎地沙坦对HeLa细胞的半数抑制浓度(IC)。

1.4 流式细胞仪测定坎地沙坦对HeLa细胞凋亡率的影响

收集对数生长期HeLa细胞，用DMEM培养基调整细胞密度，HeLa细胞按照2.0×10个/孔的数量接种至6孔板中，继续培养过夜，弃去旧培养液，加入含有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培养基，培养48 h后，弃去旧DMEM培养基，避光条件下用FITC和PI标记，具体操作按照试剂盒说明书进行，每个浓度设置6个复孔，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 透射电镜观察坎地沙坦处理后HeLa细胞中自噬体

HeLa细胞经0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理48 h后，胰酶消化，用预冷的PBS重悬HeLa细胞，离心、弃上清液，用2.5%戊二醛固定，脱水、包埋、切片，枸橼酸铅染色，透射电镜观察HeLa细胞中自噬体数。

1.6 免疫荧光检测坎地沙坦处理后HeLa细胞中p62蛋白表达

HeLa细胞以2.0×10个/孔接种至含有细胞爬片的24孔板中，培养过夜，弃旧培养基，加入有0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦的DMEM培养基，培养48 h后，弃去旧DMEM培养基，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，通透、封闭，加入兔抗人p62一抗孵育过夜，避光下加入荧光二抗，37 ℃暗室孵育3 h，滴加DAPI，37 ℃暗室孵育5 min，PBS清洗3次，滤纸吸干，封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.7 Western blot测定坎地沙坦处理后HeLa细胞中TRAIL-DR5、AMPK、ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

用RIPA液裂解不同浓度坎地沙坦处理后的HeLa细胞，4 ℃离心提取总蛋白，根据BCA试剂盒说明书测定总蛋白含量。SDS-PAGE电泳分离目标蛋白(80 V，30 min；120 V，60 min)，转至PVDF膜上，5% BSA封闭，分别加入相应兔抗人一抗(1 ∶1 000)，孵育过夜，加入羊抗兔IgG/HRP，孵育2 h，ECL显色，测定条带灰度值，蛋白相对含量=目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2 结果

2.1 坎地沙坦对HeLa细胞增殖抑制的影响

0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa细胞48 h后，增殖抑制率分别为(0.59±0.21)%、(9.54±1.06)%、(16.44±1.75)%、(30.58±4.01)%、(45.80±5.36)%、(67.33±6.17)%和(86.29±8.94)%，增殖抑制率随浓度增加而升高，具有浓度依赖性。坎地沙坦对HeLa细胞的IC为(32.38±3.46)μmol/L，参照IC值，后续实验采用0.0、15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦进行。见表1。

表1 HeLa细胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平比较

2.2 坎地沙坦对HeLa细胞凋亡的影响

0.0、15.0、30.0、60 μmol/L坎地沙坦作用于HeLa细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(1.26±0.13)%、(4.90±0.58)%、(7.18±1.05)%和(17.86±2.05)%。与0.0 μmol/L坎地沙坦相比，15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理后，HeLa细胞凋亡率升高(

P

<0.05)，且呈浓度依赖性(

P

<0.05)。见图1、表2。

图1 不同浓度坎地沙坦对HeLa细胞凋亡率的影响A:0.0 μmol/L坎地沙坦组； B:15.0 μmol/L坎地沙坦组；C:30.0 μmol/L坎地沙坦组；D:60.0 μmol/L坎地沙坦组

2.3 坎地沙坦对HeLa细胞中自噬体数目的影响

0.0 μmol/L坎地沙坦处理后，可见HeLa细胞中自噬体数目较多，经15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理后，HeLa细胞中自噬体数目减少。见图2。

图2 坎地沙坦处理后HeLa细胞中自噬体数目比较 ×20 000

2.4 坎地沙坦对p62蛋白表达的影响

0.0 μmol/L坎地沙坦理后，可见HeLa细胞中p62蛋白荧光较弱，经15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理后，HeLa细胞中p62蛋白荧光强度增强，呈浓度依赖性。见图3。

图3 免疫荧光检测p62蛋白表达 ×200

2.5 坎地沙坦处理后HeLa细胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平

与0.0 μmol/L坎地沙坦相比，经15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理后，HeLa细胞中Bax蛋白水平升高(

P

<0.05)，Bcl-2、ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(

P

<0.05)。见表1和图4。

图4 Western blot检测HeLa细胞中ATG4A、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2蛋白水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦组； B:15.0 μmol/L坎地沙坦组；C:30.0 μmol/L坎地沙坦组；D:60.0 μmol/L坎地沙坦组

2.6 坎地沙坦处理后HeLa细胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比较

与0.0 μmol/L坎地沙坦相比，经15.0、30.0、60.0 μmol/L坎地沙坦处理后，HeLa细胞中TRAIL-DR5水平升高(

P

<0.05)，p-AMPK水平降低(

P

<0.05)。见表2和图5。

图5 Western blot检测HeLa细胞中TRAIL-DR5、AMPK、p-AMPK水平A:0.0 μmol/L坎地沙坦组； B:15.0 μmol/L坎地沙坦组；C:30.0 μmol/L坎地沙坦组；D:60.0 μmol/L坎地沙坦组

表2 HeLa细胞中TRAIL-DR5、p-AMPK水平比较

3 讨论

近几年，宫颈癌的病死率和发病率居高不下，每年新增患者近50万例，主要由人乳头瘤病毒感染诱发，但具体发病机制尚未有统一定论。自噬因在肿瘤发生发展中具有双重作用而备受关注，可能成为肿瘤治疗中促进肿瘤细胞凋亡的靶点。

坎地沙坦因具有降压作用被广泛应用于临床，后因抗癌作用而成为研究热点，但是其作用机制仍在探究。研究表明坎地沙坦可抑制AngⅡ诱导的肝癌HepG2细胞增殖。本研究显示，HeLa细胞增殖抑制率随坎地沙坦处理浓度的增加而升高，说明坎地沙坦具有抑制HeLa细胞增殖的作用。Bax、Bcl-2分别为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，在凋亡进程中发挥重要作用。本研究表明，坎地沙坦处理后，HeLa细胞中Bcl-2蛋白水平降低，凋亡率及Bax蛋白水平升高，同样说明坎地沙坦可促进HeLa细胞凋亡，有望成为治疗宫颈癌的候选药物。韩燕燕研究表明，坎地沙坦可以阻断AngⅡ对HeLa细胞分泌VEGF的促进作用，从而影响HeLa细胞的转移侵袭作用，本研究将从其他途径进一步研究其作用机制。

自噬与细胞增殖密切相关，研究表明自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)可减少骨髓瘤细胞中自噬泡数量，诱导细胞凋亡。后续研究显示，三结构域蛋白21(TRIM21)在肝癌组织中低表达，上调其水平，可下调肝癌细胞中自噬相关蛋白ATG4B水平。ATG4A是调控自噬的关键蛋白，可通过促进自噬促进肿瘤转移。LC3分为I型和II型，自噬发生过程中，I型经加工后转化为II型，其中LC3II与自噬体数量呈正向关。P62在自噬发生时可结合LC3-Ⅱ蛋白形成复合物，最终在溶酶体中降解。本研究显示，经坎地沙坦处理后，HeLa细胞中p62蛋白荧光强度较强，自噬体数减少，ATG4A、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低，说明坎地沙坦可抑制HeLa细胞发生自噬，进而促进细胞凋亡。TRAIL与DR5结合，进一步与半胱天冬酶-8(caspase-8)缔合，诱导caspase-9活化，随后活化caspase-3导致肿瘤细胞凋亡。研究表明，坎地沙坦可靶向上调TRAIL-DR5水平，从而提高TRAIL介导的人肺腺癌细胞凋亡的敏感性。本研究同样显示，经坎地沙坦处理后，TRAIL-DR5水平升高，说明坎地沙坦可能通过上调TRAIL-DR5水平，抑制自噬，从而促进HeLa细胞凋亡。AMPK在细胞水平上调节能量平衡，激活后可诱导自噬，抑制癌细胞凋亡。此外，研究表明坎地沙坦可下调AMPK磷酸化水平，抑制自噬。本研究显示，坎地沙坦处理后，HeLa细胞中TRAIL-DR5水平升高，p-AMPK水平降低，说明坎地沙坦可能上调TRAIL-DR5水平从而抑制AMPK磷酸化，进而抑制自噬，促进细胞凋亡。