生物标志物在药物性肝损伤的应用进展

章 越 综述 聂 源，朱 萱 审校

药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)发生在使用中草药、膳食补充剂、化学药物及有潜在肝毒性药物的人群中，并能造成多种临床及病理表现，目前缺乏特异的诊断手段。最近一项覆盖中国大陆的多中心回顾性研究显示，每年每10万人中约有23.8例发生DILI，相比于西方国家更高。DILI是导致患者需进行肝移植甚至死亡的重要因素，最近一项研究表明，约7.6%的DILI患者在2年内会死亡。目前，传统的生物标志物在肝脏特异性及灵敏性方面存在局限性，为了准确评价临床前药物肝毒性及早期预测DILI，急需探索高特异性及灵敏性的生物标志物，该文总结了近年来DILI生物标志物方面的研究进展，旨在对DILI的早期诊断及预测提供参考。

1 传统的生物标志物

近半世纪以来，传统的生物标志物一直在临床上用于DILI的检测，如丙氨酸转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素(TBIL)等。ALT与AST存在于肝细胞内，在药物性肝损伤的过程中，血清中的ALT及AST升高，这与肝细胞的死亡及其释放内容物相关。血清ALP的升高和胆管上皮细胞损伤相关，TBIL的升高可能反映了肝细胞功能受损，或与胆红素生产与加工有关。Tonomura et al研究表明，在多种肝毒性化合物引起小鼠肝损伤的模型中，对于DILI的预测，这些传统的生物标志物没有很大的价值。鉴于这些因素，DILI的识别及预测需要开发新型生物标志物。

2 新型生物标志物

2.1 肝脏特异性生物标志物

虽然ALT升高被认为是肝脏特异性的表现，但在某些情况下，ALT升高的原因并不一定与肝脏损伤有关，这就需要探索出肝脏特异性更强的生物标志物。最近发现2种新的DILI生物标志物：谷氨酸脱氢酶(GLDH) 和miRNA-122。这2种生物标志物均已收到美国食品和药物管理局和欧洲药物管理局的支持信，支持作为肝脏特异性候选生物标志物。GLDH是一种在细胞有丝分裂中嵌入线粒体基质的蛋白质，参与了谷氨酸的氧化脱氨，由于肝脏富含线粒体基质，因此肝脏中GLDH含量很高，而肾脏及大脑中含量则低得多。Mcgill et al研究表明，过量对乙酰氨基酚(APAP)所致肝衰竭患者相比于健康人血清GLDH明显增高[(684±86)

vs

(11±1) U/L,

P

<0.05)]。Thulin et al在小鼠APAP的肝脏毒性实验中表明，高剂量APAP注射后，小鼠血清GLDH与ALT在24 h内显著升高，而血清GLDH升高程度明显高于ALT，在预测APAP所致小鼠肝坏死中，GLDH准确性明显高于ALT，ROC曲线分析显示，曲线下面积(AUC)为0.99

vs

0.97,表明GLDH可以作为判断肝损伤的生物标志物。miRNA-122是肝脏中含量最丰富的miRNA，约占肝脏总miRNA的70%，并且它几乎只能在肝脏中才能发现，这也反映了其极高的肝脏特异性。Sharapova et al在4种不同肝毒性化合物诱导的大鼠毒性试验中表明，在预测肝损伤中，miRNA-122准确性高于ALT(AUC:90.85

vs

82.29)，并表明在血清ALT、AST及GLDH基础上，纳入miRNA-122指标可以使诊断的准确性从82%提高至86%。最近，Dear et al在一项患者服用过量APAP造成肝损伤的研究中表明，miRNA-122预测ALT升高的准确性最高，是一种用于检测APAP诱导肝损伤敏感及可早期预测的生物标志物。然而，与其他生物标志物不同的是，miRNA-122不仅仅从受损的肝细胞中释放，在无肝细胞受损而应对刺激时，miRNA-122可被激活用于调节先天免疫细胞与肾脏促红细胞生成素的释放。Church et al研究表明，无论是患者个体内还是个体间变异，miRNA-122的变异系数明显高于血清GLDH。这说明GLDH具有变异率低及稳定性高的特点，在DILI诊断中比miRNA-122更有价值。鉴于这些原因，美国的安全预测试验联盟(PSTC)放弃了将miRNA-122作为肝脏特异性生物标志物的研究转而支持GLDH。

2.2 早期预测DILI的生物标志物

肝毒性药物导致肝损伤的过程中一些生物标志物浓度会逐渐升高，而早期检测药物性肝损伤对治疗方案的选择及患者疗效有重要意义。

高迁移率族蛋白(HMGB-1)是一种氨基酸序列高度保守且含量最丰富的蛋白，大多数存在于细胞核内，并参与基因转录、核小体组装及DNA复制修复。经过各种修饰翻译后可以将HMGB-1转移到细胞质中，甚至促进其分泌。例如HMGB-1乙酰化发生在炎症过程中，然后以乙酰化的形式分泌出来。因此乙酰化HMGB-1可作为炎性的生物标志物，而HMGB-1作为坏死的生物标志物具有被动释放的作用。Dear et al通过研究表明，首次入院若HMGB-1正常，则可以排除肝损伤。已有研究表明，HMGB-1在ALT升高之前会出现，能够早期检测出肝损伤。

细胞角蛋白18(CK18)是细胞骨架的一部分，一种与细胞凋亡相关的蛋白质分子。当肝细胞受损时，CK18会被动地从细胞中释放出来。Church et al研究表明，在DILI患者中CK18显示出了预后生物标志物的价值，与存活的患者相比，死亡或进行肝移植的患者CK18水平显著增加，并且MELD评分在20～29分时合并CK18及MCSFR相比于仅仅使用MELD评分预测死亡或需肝移植患者敏感性提高，且不降低其特异性。另外，细胞凋亡时全长角蛋白18经胱天蛋白酶介导形成半胱天冬酶切割片段(ccK18),ccK18/角蛋白18值定义为AI,能够反映细胞凋亡的比例,DILIN患者的试验数据表明,死亡或需要肝移植的患者AI值偏低,认为AI可能有助于预测肝组织中细胞凋亡与坏死的程度。Antoine et al在研究首次入院由APAP造成患者肝损伤的早期敏感指标中结果显示，ccK18在预测早期DILI患者肝损伤发展程度方面优于ALT(AUC:0.80

vs

0.52)。可以看出，无论是HMGB-1还是ccK18都能较好地预测早期DILI，最近FDA和欧洲药品局也支持ccK18作为预测DILI患者预后的生物标志物。

2.3 肝脏再生生物标志物

肝脏的修复和再生对于急性肝损伤患者的存活至关重要，这衍生了一个新的想法，即再生生物标志物可能比前面描述的损伤或炎症标志物能更好地预测患者的预后。

甲胎蛋白在十余年前已经被证实是肝细胞增殖的生物标志物，能够预测过量服用APAP患者的生存结局，而其最大的缺点在于急性肝损伤发生2～3 d后才能预测，即不能在早期预测DILI的预后。而到那时，由于肝性脑病或者其他并发症，患者可能不再适合进行肝移植。

骨桥蛋白(OPN)作为一种促炎细胞因子，可能在肝细胞坏死相关的炎症性肝病中发挥重要作用。在正常肝脏中，OPN在静止库普弗细胞中的表达是最低的，一旦肝损伤发生，库普弗细胞或自然杀伤T淋巴细胞被激活，从而表达OPN和其他细胞因子。由于肝脏干细胞的活化，OPN被认为与肝脏再生有关。最近有研究表明OPN可以促进部分肝切除术后啮齿动物的肝脏再生。Church et al通过研究严重肝损伤患者的预后生物标志物表明，DILI死亡患者的OPN高于存活者，并表明在所有候选生物标志物中，OPN能够更好地预测患者的预后(AUC:0.858)。

最近的一项研究表明，APAP过量后，小鼠和人的肝脏组织和血浆中的脂质磷脂酸(PA)均升高，这对肝脏再生信号传导具有重要作用。因此，PA可能是一种有前途的肝脏再生生物标志物,仍需在今后的实验中对DILI存活者和死亡者的PA值进行比较分析验证这一点。

2.4 预测慢性DILI生物标志物

目前，还没有生物标志物能够可靠地预测哪些DILI患者的病程会延长，哪些会迅速恢复。然而，对大量DILI患者分析表明，与没有DILI的对照组相比，发展为慢性DILI的患者在损伤发生时ALP和TBIL水平升高。Church et al在对19例未恢复的DILI患者的随访中发现有6例患者在6个月的随访中ALP水平是升高的，并且进一步分析数据显示，谷胱甘肽转移酶α(GST-α)在ALP升高的患者中显著降低(AUC：0.760)。而慢性DILI的生物标志物仍需要大量研究去探索。

2.5 胆汁淤积性DILI的生物标志物

胆汁淤积性肝损伤的早期症状为黄疸，且发生在肝功能损害之前，旧观点认为这种类型的DILI没有肝细胞损伤那么令人担忧。而最近的一项研究表明，胆汁淤积性DILI 6个月后病死率可达10%。此外，胆汁淤积性肝损伤比肝细胞损伤或混合性肝损伤更容易发展为慢性肝损伤，而这可能需要数月时间才能恢复，患者也可能进展为肝衰竭。

目前预测胆汁淤积性DILI的常用生物标志物是ALP，它存在于胆汁和胆管上皮细胞中。ALP在骨骼中也有很高的含量，这可能会与骨骼中是否存在疾病或损伤相混淆。GGT也不是肝脏特异性的，它在肾、脑和睾丸中高表达，由于乙醇和某些药物引起酶的诱导作用，其在血清中的水平升高。由药物所致胆汁淤积性肝损伤的严重程度在临床上无法得到可靠的监测，这就需要有新的生物标志物对其进行预测分析。

在最近的一项研究中，小鼠在一定剂量的α-萘异硫氰酸酯(ANIT)或每日剂量的固有化合物诱导下出现胆道闭锁，从而导致胆汁淤积，血清miRNA被用来验证肝损伤和肝脏再生的敏感生物标志物。miR-200家族的几个成员在胆道损伤中被发现明显升高，并且从胆道闭锁患者中收集的血清中表明，miR-200家族成员的含量明显升高，进而支持了它们在胆汁淤积性中的作用。

Lopez-Riera et al纳入胆汁淤积及肝细胞性DILI患者,细胞水平分析中表明，探索区分胆汁淤积性DILI及肝细胞DILI的生物标志物中，miR-122/miR-451a值的AUROC值为0.956，其灵敏度达100%，而另一个表现出较好的预测潜力的为miR-122/miR-16值，其AUROC值为0.936。这些新的生物标志物可应用到实验室检测中，从而对DILI的诊断及分类有很大价值。

2.6 基因组生物标志物

人类白细胞抗原(HLA)参与免疫系统的激活，具有高度多态性，而DILI与HLA之间存在着一定的相关性。过去的15年中，人们在确定DILI的遗传风险因素方面取得了越来越多的进展，特别是已经报道了由一系列药物引起的DILI与HLA I类和II类等位基因的关联。Urban et al对25例米诺环素导致的DILI患者与10 588例未发生DILI的对照组进行HLA位点的基因分型，结果显示，DILI患者中携带HLA-B×35:02等位基因的频率高于对照组(16%

vs

0.6%,

P

=2.5×10)，即HLA-B×35:02等位基因可能是米诺环素所致DILI患者易感性的危险因素。此外，HLA-B×35:02可将米诺环素所致DILI与特发性自身免疫性肝炎区分，恰恰这两者都有相似的血清学标志物，如抗核抗体(ANAs)与抗平滑肌抗体(SMAs),但还需要进一步研究证实。Nicoletti et al对全基因组关联研究(GWAS)的6例氟吡汀导致的DILI患者与10 588例未发生DILI人群对照组比较，在基因分析中发现，DRB1×16:01及DQB1×05:02与氟哌啶导致的DILI存在明显关联，两者等位基因频率为(0.25

vs

0.013,

P

=1.4×10)，并发现携带这种单链型基因的患者发生临床显著药物性不良反应的风险比正常人高19倍。可以看出，基因分型可用于排除因特殊药物引起的肝脏不良反应，可以预见的是，HLA等个人基因信息以后可在临床上常规获取，以帮助临床精确用药，并将药物不良反应降至最低。

3 小结与展望

DILI作为药物最严重的不良反应之一，已经引起药物研发机构及临床医师的高度关注，而DILI发病机制复杂，发病时间存在差异性，并且免疫反应、线粒体功能障碍、氧化应激等对DILI也有重要的影响，又由于缺乏特异性的诊断标志，常被患者及医师漏诊。因此，发展新型生物标志物有利于更快更准确地诊断DILI，从而优化DILI患者的治疗方案。而新型生物标志物由于缺乏广泛验证，限制了其应用范围，因此需要在使用多种药物治疗的大量患者中进行试验。新型生物标志物需要与传统生物标志物结合起来，从而给早期诊断及预测DILI带来突破。目前，DILI生物标志物现在仍存在着各种局限性及需要解决的问题，但随着组学技术、生命科学及分子学的不断发展，相信在未来可以探索出特异性及敏感性更高的新型生物标志物，从而提高DILI生物标志物的临床应用范围及价值。