APP下载

miR-181靶向TIMP3调控胆囊癌细胞迁移及侵袭的实验研究

2021-04-09刘学停孙艳军孙登群吴文涌

安徽医科大学学报 2021年4期
关键词:胆囊癌质粒靶向

刘学停,蔡 军,孙艳军,孙登群,吴文涌

胆囊癌是发生于胆囊及胆囊管的恶性肿瘤,起病隐匿且恶性程度高,临床治疗效果不佳、预后极差。胆囊癌手术切除后容易发生转移,对放化疗敏感性较差,目前尚缺乏能够有效杀伤胆囊癌细胞、延长胆囊癌患者生存时间的治疗手段。胆囊癌的发病机制复杂,癌细胞极强的迁移和侵袭能力是造成肿瘤转移的重要生物学行为,但调控胆囊癌细胞迁移、侵袭的关键分子尚未阐明,因此也缺乏相应的靶向治疗方式。微小RNA(microRNAs,miRs)是一种在转录后水平调控多种基因表达的非编码小分子RNA,在多种恶性肿瘤的发生发展中,存在多种miRs表达的上调或下调。miR-181是一种具有促癌活性的miR,已经被证实在结直肠癌、食管癌、胆囊癌等多种消化系统恶性肿瘤中呈高表达趋势;国内何政 等细胞实验表明了miR-181对胆囊癌细胞迁移和侵袭的促进作用,但具体的机制及miR-181在活体水平促进胆囊癌生长的作用仍未见报道。

金属蛋白酶组织抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinases 3,TIMP3)是迁移和侵袭的抑制分子,通过抑制多种金属蛋白酶对细胞外基质的水解作用来使细胞的迁移和侵袭受到抑制。在胆囊癌中,TIMP3的表达下调;在Targetscan网站中进行的生物信息学分析则显示TIMP3基因mRNA的3′UTR中含有miR-181的结合位点,从生物信息学角度推测miR-181能够靶向抑制TIMP3并起到促进癌细胞迁移、侵袭的作用。基于此,该实验将以胆囊癌GBC-SD细胞为实验对象,具体分析了miR-181靶向TIMP3调控细胞迁移及侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞

胆囊癌GBC-SD细胞株购自美国ATCC细胞公司,液氮中冷冻保存。

1.2 动物

BALB/c裸小鼠,4~6周龄,18~20 g,购自菲诺克生物科技(上海)有限公司,许可证号:SCXK(沪)2018-0005。

1.3 试剂

miR-181 mimic及阴性对照(NC)mimic、TIMP3 siRNA及NC siRNA均购自上海吉玛公司;表达 TIMP3的重组质粒及空白质粒购自上海生工公司;包含TIMP3基因mRNA野生型3′UTR、突变型3′UTR的双荧光素酶报告基因质粒购自广州云舟生物公司;转染试剂Lipofectamine2000购自美国Thermo公司;miRNA提取试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒购自北京康为世纪公司;兔来源TIMP3单克隆一抗购自美国Abcam公司;结晶紫购自美国Sigma公司。

1.4 仪器

细胞培养箱购自中国Thermo公司;荧光定量PCR仪购自上海Bio-rad公司;正置显微镜购自中国Olympus公司;凝胶成像仪购自上海勤翔公司。

1.5 方法

1.5.1

细胞培养及干预 胆囊癌GBC-SD细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养,每2 d更换1次培养基,待细胞铺满培养瓶底面80%~90%后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代,传代后的细胞接种在培养板内并进行分组干预。对照组转染NC mimic,miR-181组转染miR-181 mimic,NC-siRNA组转染NC siRNA,TIMP3-siRNA组转染TIMP3 siRNA,对照质粒组转染空白质粒,对照质粒+miR-181组同时转染空白质粒和miR-181 mimic,TIMP3质粒+miR-181组同时转染表达TIMP3的重组质粒和miR-181 mimic。每个干预条件做4个复孔。

1.5.2

荧光定量PCR检测miR-181的表达 取12孔板内分组干预的细胞,按照miRNA提取试剂盒操作、分离miRNA,按照miRNA cDNA第一链合成试剂盒操作、将miRNA反转录为cDNA,按照miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系,对miR-181及U6进行PCR反应,PCR程序为:95 ℃预变性3 min、95 ℃,15 s及60 ℃,34 s重复40个循环,软件中生成PCR循环曲线及循环阈值(Ct),根据公式2计算miR-181的表达量。

1.5.3

Western blot检测TIMP3的表达 取12孔板内分组干预的细胞,用RIPA裂解液提取细胞中的蛋白,测定蛋白含量后取30 μg蛋白进行Western blot检测,将蛋白加入SDS-PAGE,电泳后电转移至NC膜,用5%脱脂牛奶在室温封闭NC膜1 h,用1 ∶1 000稀释的TIMP3抗体或1 ∶5 000稀释的β-actin抗体在4 ℃孵育NC膜过夜。第2天,用1 ∶1 000稀释的HRP二抗在室温孵育NC膜1 h,最后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带,根据条带的灰度值、以β-actin为内参计算蛋白表达量。

1.5.4

Transwell检测细胞的迁移及侵袭 检测迁移时,将200 μl密度为2×10/ml的细胞悬液加入Transwell上室内;检测侵袭时,在Transwell上室内预涂基质胶后,将200 μl密度为2×10/ml的细胞悬液加入Transwell上室内。在Transwell下室内加入500 μl含有10%胎牛血清的DMEM用以趋化细胞发生迁移或侵袭。按照1.5.1分组干预后24 h,取出上室并用磷酸盐缓冲液漂洗3遍,将未迁移或侵袭的细胞用棉签擦去,用4%多聚甲醛固定过夜,第二天用结晶紫进行染色并在显微镜下观察迁移或侵袭的细胞数目。

1.5.5

双荧光素酶报告基因验证miR-181靶向TIMP3 将500 μl密度为2×10/ml的细胞悬液接种在24孔培养板中,贴壁生长且密度达到50%后,将双荧光素酶报告基因质粒及miR-181mimic或NC mimic共同转染进入细胞,转染24 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别测定萤火虫荧光活力及海肾荧光活力,计算萤火虫荧光活力/海肾荧光活力的值,以该比值作为双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力。

1.5.6

移植瘤模型建立及干预 转染NC mimic的胆囊癌GBC-SD细胞及转染miR-181 mimic的胆囊癌GBC-SD细胞、调节细胞密度至5×10/ml,取100 μl接种在裸鼠背部皮下,28 d后处死裸鼠、解剖移植瘤,测量移植瘤质量,按照荧光定量PCR的方法检测移植瘤中miR-181的表达量,按照Western blot的方法检测移植瘤中TIMP3的表达量。

2 结果

2.1 过表达miR-181对GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响

miR-181组GBC-SD细胞中miR-181的表达量高于对照组,差异有统计学意义(

t

=7.104,

P

<0.05)(图1A),迁移细胞数目及侵袭细胞数目多于对照组,差异有统计学意义(

t

=5.475、6.949,

P

<0.05)(图1B、C)。

图1 过表达miR-181对GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响A:PCR检测miR-181的表达量;B:Transwell检测细胞迁移×200;C:Transwell检测细胞侵袭×200;与对照组比较:*P<0.05

2.2 过表达miR-181对GBC-SD细胞中TIMP3的靶向调控

过表达miR-181对GBC-SD细胞中TIMP3的靶向调控,miR-181组GBC-SD细胞中TIMP3的表达量低于对照组,差异有统计学意义(

t

=4.770、

P

<0.05)(图2A);生物信息学预测,TIMP3基因mRNA 3′ UTR上有miR-181的结合位点(图2B);miR-181组GBC-SD细胞中TIMP3基因mRNA野生型3′ UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力低于对照组,差异有统计学意义(

t

=5.547、

P

<0.05),突变型3′ UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力与对照组比较,差异无统计学意义(图2C)。

图2 过表达miR-181对GBC-SD细胞中TIMP3的表达调控Western blot检测TIMP3的表达量;B:生物信息学预测miR-181靶向TIMP3基因mRNA 3′ UTR;C:双荧光素酶报告基因实验验证miR-181靶向TIMP3基因mRNA 3′ UTR;与对照组比较:*P<0.05

2.3 敲低TIMP3对GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响

TIMP3-siRNA组GBC-SD细胞中TIMP3的表达量低于NC-siRNA组,差异有统计学意义(

t

=4.717、

P

<0.05)(图3A),迁移细胞数目及侵袭细胞数目多于NC-siRNA组,差异有统计学意义(

t

=4.707、5.069,

P

<0.05)(图3B、C)。

图3 敲低TIMP3对GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响A:Western blot检测TIMP3的表达量;B:Transwell检测细胞迁移×200;C:Transwell检测细胞侵袭×200;与NC-siRNA组比较:*P<0.05

2.4 过表达TIMP3对miR-181调控GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响

对照质粒+miR-181组GBC-SD细胞中TIMP3的表达量低于对照质粒组,TIMP3质粒+miR-181组GBC-SD细胞中TIMP3的表达量高于对照质粒+miR-181组,差异有统计学意义(

F

=7.729、

P

<0.05)(图4A);对照质粒+miR-181组GBC-SD细胞迁移细胞数目及侵袭细胞数目多于对照质粒组,TIMP3质粒+miR-181组GBC-SD细胞的迁移细胞数目及侵袭细胞数目少于对照质粒+miR-181组,差异有统计学意义(

F

=12.408、12.361,

P

<0.05)(图4B、C)。

图4 过表达TIMP3对miR-181调控GBC-SD细胞迁移及侵袭的影响A:Western blot检测TIMP3的表达量;B:Transwell检测细胞迁移×200;C:Transwell检测细胞侵袭×200;与对照质粒组比较:*P<0.05;与对照质粒+miR-181组比较:#P<0.05

2.5 过表达miR-181对GBC-SD移植瘤生长及TIMP3表达的影响

miR-181组荷瘤鼠的移植瘤质量(0.91±0.18)g高于对照组(0.39±0.09)g,差异有统计学意义(

t

=6.329、

P

<0.05)(图5A),移植瘤中miR-181的表达量(2.08±0.52)高于对照组(0.72±0.15),差异有统计学意义(

t

=4.673、

P

<0.05)(图5B),移植瘤中TIMP3的表达量(0.67±0.19)低于对照组(1.38±0.32),差异有统计学意义(

t

=6.155、

P

<0.05)(图5C)。

图5 过表达miR-181对GBC-SD移植瘤生长及TIMP3表达的影响A:移植瘤的质量;B:PCR检测miR-181的表达量;C:Western blot检测TIMP3的表达量;与对照组比较:*P<0.05

3 讨论

胆囊癌细胞极强的迁移和侵袭能力是胆囊癌发生转移的生物学基础,探寻胆囊癌细胞迁移和侵袭的关键调控分子及相应分子机制有助于发现新的胆囊癌治疗靶点。miR-181是一种具有促癌活性的miR,多项细胞实验表明miR-181对乳腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤等恶性肿瘤细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为具有促进作用。国内何政 等关于胆囊癌的研究表明,miR-181在胆囊癌组织中的表达增加,提示miR-181可能参与胆囊癌的发生且高表达的miR-181可能起到促癌作用。基于此,该实验将以胶质瘤GBC-SD细胞为实验对象,具体分析miR-181在胆囊癌细胞迁移、侵袭中的调控作用及分子机制,以期为阐明胆囊癌的发生机制、探寻胆囊癌的治疗靶点提供依据。

该实验通过转染miR-181 mimic的方式来增加GBC-SD细胞中miR-181的表达,过表达miR-181后在Transwell中检测了细胞的迁移和侵袭,结果显示:GBC-SD细胞的迁移数目和侵袭数目均增多,说明miR-181能够促进胆囊癌细胞的迁移和侵袭。结合靶基因mRNA 3′UTR并促进mRNA降解、阻碍mRNA反应是miR发挥基因表达转录后调控的方式,该实验在Targetscan网站中的生物信息学分析显示:迁移和侵袭抑制基因TIMP3的3′UTR上含有miR-181的结合位点;在转染miR-181 mimic后,GBC-SD细胞中TIMP3的表达减少,含有TIMP3基因mRNA野生型3′UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力降低,而在将Targetscan预测的miR-181结合位点进行突变后、转染miR-181 mimic未能使荧光素酶活力降低,说明miR-181能够靶向TIMP3基因mRNA的3′UTR且靶向结合的位点与Targetscan网站的预测一致。

TIMP3是TIMP家族中的特殊成员,属于非可溶性蛋白,能够直接抑制多种金属蛋白酶的水解活性,使细胞水解细胞外机制的能力减弱,进而抑制细胞的迁移和侵袭。在肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中,TIMP3的表达减少;相关细胞实验表明,多种miR能够靶向TIMP3并发挥促癌作用。该实验在GBC-SD细胞中验证了TIMP3的生物学作用。在转染TIMP3-siRNA时TIMP3的表达减少后,GBC-SD细胞的迁移和侵袭受到抑制,说明TIMP3参与胆囊癌细胞迁移和侵袭的调控。在此基础上,该实验还通过转染TIMP3基因重组质粒的方式来验证靶向抑制TIMP3在miR-181调节胆囊癌迁移和侵袭中的作用,增加TIMP3基因的表达后,miR-181促进细胞迁移和侵袭的作用均减弱,进一步表明了miR-181促进胆囊癌细胞迁移、侵袭的作用与靶向抑制TIMP3基因的表达有关。

在上述细胞学实验观察到miR-181促进胆囊癌细胞迁移、侵袭后,该实验还进一步通过荷瘤鼠来验证miR-181促进胆囊癌生长的作用。将转染了miR-181 mimic或NC mimic的胆囊癌细胞接种在裸鼠皮下后形成移植瘤,通过比较移植瘤的生长及TIMP3的表达可知:转染miR-181 mimic细胞形成的移植瘤质量减轻、TIMP3的表达增加,这一结果与miR-181在离体GBC-SD细胞中促进迁移及侵袭、抑制TIMP3基因表达的作用吻合,说明miR-181能够促进胆囊癌的生长且这一促进作用与靶向抑制TIMP3有关。

猜你喜欢

胆囊癌质粒靶向
基因工程中载体概述
农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介
——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展
“六步四环”单元教学靶向课堂提质
靶向免疫联合三维适形放疗治疗晚期原发性肝癌患者的疗效观察
叶酸靶向anti-miR-221阴离子脂质体的制备及体外抗肿瘤作用
开发新方法追踪植物病害的全球传播(2020.6.7 iPlants)
小鼠转录因子STATl真核表达质粒的构建及生物学功能分析
如何理性看待肿瘤靶向治疗
DNA 突变让老美易患胆囊癌
胆囊癌26例超声诊断分析