miR⁃488⁃3p在子痫前期胎盘滋养层细胞侵袭和迁移中的作用研究

吴琪瑞 王艳华 刘林英 高丽娜 殷荷 张玉月 韩可栋 张慧萍，4，5

宁夏医科大学1临床医学院，2总医院，3基础医学院（银川750004）；4国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室；5宁夏血管损伤与修复研究重点实验室（银川750004）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种多系统受累的妊娠特异性综合征，是导致孕产妇发病和死亡的主要原因之一［1］。研究发现，PE 会增加孕妇发生肺水肿、羊水栓塞、急性肾功能衰竭和死亡的风险；同时，也会增加新生儿不良结局的风险，如早产、流产、呼吸窘迫综合征和死亡等，严重威胁母婴健康［2-3］。然而，PE 的发病机制目前尚不清楚，亟待进一步研究。MicroRNA（miRNA）是一种长度约为22 个核苷酸的小的单链非编码RNA，参与调节人类细胞中约三分之一的蛋白质编码基因，通过抑制mRNA 翻译和降低mRNA 稳定性来调节基因表达从而参与细胞增殖、分化和凋亡等一系列生命活动［4-5］。有文献报道［6-7］，与正常孕妇相比，PE 患者胎盘和血清中的某些miRNA 存在差异表达，提示miRNA 可能参与了PE 的发生发展。其中，miR⁃488⁃3p 已被证实在多种癌症中是一种肿瘤抑制因子，但其在PE 中的作用尚不清楚。故本研究探讨miR⁃488⁃3p 在人胎盘滋养层细胞侵袭和迁移中的作用，并进一步探讨其在PE 中的临床价值，为PE 的诊断及治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月至2018年2月宁夏国龙妇产医院收治的PE 患者30 例和同期健康妊娠分娩的正常孕妇（normal pregnancy，NP）30 例。纳入标准：妊娠20 周后出现收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90 mmHg，同时伴有蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h 或随机尿蛋白≥+），且无消耗性疾病。组织标本收集前征得所有孕产妇同意并签署知情同意书，组织收集后均冻存于-80 ℃冰箱。本实验经宁夏医科大学总医院伦理委员会审查批准。NP和PE 组临床资料比较，除孕妇年龄和孕周外，差异均具有统计学意义。见表1。

表1 NP 和PE 组临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between NP and PE groups x±s

1.2 主要试剂人绒毛膜滋养层细胞（HTR⁃8/SV⁃neo）购于上海复旦细胞库；胎牛血清、RPMI⁃1640培养基（美国，Gibco）；青链霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索莱宝）；总RNA 提取试剂盒（北京，天根）；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（日本，Taka⁃ra）；Matrigel 基质胶（美国，BD）；Transwell 小室（美国，Corning）；miR⁃488⁃3p mimic 及NC 和miR⁃488⁃3p inhibitor 及NC（上海，吉玛）；miR⁃488⁃3p 和U6引物由广州锐博公司合成，MMP2 和GAPDH 引物由上海生工公司合成，序列见表2。

表2 MMP2 和GAPDH 引物序列Tab.2 MMP2 and GAPDH primer sequences

1.3 细胞培养及转染在37 ℃、5%CO2的培养箱中，使用含有7%胎牛血清、100 μg/mL 青链霉素的RPMI⁃1640 培养基培养滋养层细胞，细胞长至90%融合度时用胰蛋白酶进行传代，每1 ～2 d换一次培养液。同时，待培养瓶中细胞长至60%～70%融合度时添加转染试剂，细胞分5 组：con⁃trol、miR⁃488⁃3p NC、miR⁃488⁃3p mimic、inhibitor NC 和miR⁃488⁃3p inhibitor，培养4⁃6 h 后弃原培养基，更换新培养基培养48 h 后，收取细胞进行后续实验。

1.4 细胞迁移实验将转染48 h 后的细胞重悬，计数，按1 × 105细胞/孔接种于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含有15%血清的完全培养基，继续培养48 h。取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，用棉签擦去上室未迁移的细胞，晾干，100 倍倒置显微镜下计数并拍照，每个小室随机取5 个视野进行计数。

1.5 细胞侵袭实验提前将Matrigel 基质胶从-20 ℃取出放在4 ℃过夜使其融化，次日在冰上按照1∶8 的比例用无血清RPMI⁃1640 稀释并混匀，加入Transwell 小室100 μL，摇匀，放入恒温细胞培养箱过夜使胶凝固。余步骤与细胞迁移实验相同。

1.6 Real⁃time PCR 检测分别按照总RNA 提取试剂盒说明书提取胎盘组织和滋养细胞的总RNA，样本OD260/280 控制在1.8 ～2.0，然后按照说明书逆转录合成cDNA，并置于荧光定量PCR 仪进行扩增，总体系为20 μL。

1.7 统计学方法所有实验至少重复3 次，结果以表示，用Prism 7.0 统计软件处理数据。两组间差异采用独立样本t检验比较，多组间两两比较采用单因素方差分析，miR⁃488⁃3p 与PE 临床特征的关系采用pearson 相关性分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃488⁃3p 在PE 胎盘组织中的表达水平qRT⁃PCR 检测结果显示，与NP 组比较，PE 组miR⁃488⁃3p 的表达水平显著升高（P＜0.01），提示miR⁃488⁃3p 在PE 患者胎盘组织中高表达，其可能参与PE 的发生发展，见图1。

2.2 miR⁃488⁃3p 的表达水平与临床特征的相关性分析如图2，miR⁃488⁃3p 的表达水平与收缩压（r= 0.377 2，P= 0.003 0）、舒张压（r= 0.323 8，P=0.011 6）均有显著正相关性，进一步提示miR⁃488⁃3p 与PE 密切相关，且miR⁃488⁃3p 的表达水平可能与PE 病情严重程度呈正相关。

图1 miR⁃488⁃3p 在NP 和PE 胎盘组织中的表达水平Fig.1 Expression of miR⁃488⁃3p in placenta of NP and PE

图2 胎盘组织中miR⁃488⁃3p 的表达与临床特征的关系Fig.2 Relationship between expression of miR⁃488⁃3p and clinical features in placenta

2.3 miR⁃488⁃3p 对滋养层细胞侵袭能力的影响如图3，mimic 组中miR⁃488⁃3p 表达高于mimic⁃NC组（P＜0.001），而inhibitor 组中的miR⁃488⁃3p 表达低于inhibitor⁃NC 组（P＜0.05），提示过表达miR⁃488⁃3p 及抑制miR⁃488⁃3p 细胞构建成功。Tran⁃swell 侵袭实验结果显示：与mimic⁃NC 组比较，mimic 组的侵袭细胞数明显减少（P＜0.01）；相反，与inhibitor⁃NC 组比较，inhibitor 组的侵袭细胞数显著增多（P＜0.01），提示过表达miR⁃488⁃3p 可抑制滋养层细胞的侵袭能力，而抑制miR⁃488⁃3p 后则相反，见图4。

图3 转染miR⁃488⁃3p mimic 和inhibitor 后miR⁃488⁃3p 的表达Fig.3 Expression of miR⁃488⁃3p after transfection of miR⁃488⁃3p mimic and inhibitor

图4 miR⁃488⁃3p 对滋养层细胞侵袭的影响Fig.4 Effect of miR⁃488⁃3p on trophoblast cells invasion

2.4 miR⁃488⁃3p 对滋养层细胞迁移能力的影响如图5，转染mimic 和inhibitor 后，滋养层细胞迁移能力的变化与侵袭能力呈现相同的趋势，提示过表达miR⁃488⁃3p 可抑制滋养层细胞的迁移能力，而抑制miR⁃488⁃3p 后则相反。

2.5 生物信息软件预测MMP2 是miR⁃488⁃3p 可能作用的靶基因软件分析发现，MMP2 mRNA 3′UTR 与miR⁃488⁃3p 有结合位点，提示MMP2 可能是miR⁃488⁃3p 的下游靶基因，见图6。

图5 miR⁃488⁃3p 对滋养层细胞迁移的影响Fig.5 Effect of miR⁃488⁃3p on trophoblast cells migration

图6 miR⁃488⁃3p 与MMP2 的预测结合位点Fig.6 Predicted binding sites of miR⁃488⁃3p and MMP2

2.6 MMP2 mRNA在PE胎盘组织中的表达qRT⁃PCR 检测MMP2 在 上 述30 例PE 组 及30 例NP 组胎盘组织中的表达，结果如图7，PE 组中MMP2 含量低于NP 组（P＜0.05）。MMP2 在胎盘组织中的表达水平与miR⁃488⁃3p 相反，提示miR⁃488⁃3p 可能对MMP2 有负向调节作用。

图7 MMP2 在NP 和PE 胎盘组织中的表达水平Fig.7 Expression of MMP2 in placental tissues of NP and PE

2.7 miR⁃488⁃3p对滋养层细胞中MMP2表达的影响同时，qRT⁃PCR 结果显示，与NC 组比较，过表达miR⁃488⁃3p 明显抑制MMP2 的表达（P＜0.001）；相反，miR⁃488⁃3p 表达下调增加MMP2 的表达（P＜0.05），提示miR⁃488⁃3p 可能通过抑制MMP2的表达调控滋养层细胞的侵袭和迁移，见图8。

图8 miR⁃488⁃3p 对滋养层细胞中MMP2 表达的影响Fig.8 Effect of miR⁃488⁃3p on the expression of MMP2 in trophoblast cells

3 讨论

PE 是一种以高血压和蛋白尿为主要临床表现的妊娠并发症，它影响全世界2%至8%的孕妇，是孕产妇和新生儿死亡的主要原因［8］。目前临床上，分娩是唯一已知的治愈方法，而其它治疗手段只是起到控制病情和延缓孕周的目的［9］。近些年，随着分子生物学和非编码RNA的发展，miRNA的分子靶向精准治疗为临床PE治疗提供了新的思路。

越来越多的数据证明，miRNA能够参与调控滋养层细胞分化、迁移、侵袭、增殖、凋亡、血管生成和细胞代谢等多种生物学过程［10-12］。其中，miR⁃488⁃3p已被证实在食管鳞癌、小细胞肺癌等多种肿瘤组织中低表达，其作为一种肿瘤抑制因子参与肿瘤的发生发展［13-14］。同时，在急性痛风性关节炎等非肿瘤性疾病中miR⁃488⁃3p 也发挥着重要作用［15］。但关于miR⁃488⁃3p 在PE 中的表达及作用机制尚未见研究。本研究发现，miR⁃488⁃3p 在PE 胎盘组织中呈高表达，同时miR⁃488⁃3p 的表达水平与PE收缩压、舒张压正相关，提示miR⁃488⁃3p 的高表达与PE 的发生发展密切相关，并可能随着PE 病情加重表达增加，同时，miR⁃488⁃3p 也可能成为PE治疗的靶点及早期诊断的分子标记物。

临床和病理研究表明胎盘在PE 的发病机制中处于中心地位；而滋养层细胞作为胎盘的主要成分，其浸润不足是PE 最突出的病理特征，也是PE 发生发展的关键因素［16-17］。滋养层细胞的侵袭和迁移特性与肿瘤细胞相似，但不同的是滋养层细胞具有严格的时空限制和精细调控，同时仅限于子宫的早期妊娠［18］。本研究结果显示，当miR⁃488⁃3p 抑制表达后，滋养层细胞的侵袭和迁移能力增强，相反，miR⁃488⁃3p 进一步诱导表达后滋养层细胞侵袭和迁移能力显著减弱。

miRNA 通常在转录后水平调控基因的表达，参与多种生理过程［5］。本研究通过生物信息学分析发现MMP2 3′UTR 区与miR⁃488⁃3p 存在可结合的位点，推测MMP2 可能是miR⁃488⁃3p 的下游靶基因。MMP2 是基质金属蛋白酶（MMPs）家族中的一员，能特异性降解Ⅳ型胶原酶等多种细胞外基质，从而为细胞的侵袭迁移提供有利条件。研究表明，在妊娠早期，MMP2 的减少干扰了妊娠早期螺旋动脉的正常重构，导致了PE 最初的病理生理变化［19］。本研究结果显示MMP2 在PE 胎盘组织中的含量低于NP 组，与miR⁃488⁃3p 的表达水平负相关；同时，滋养层细胞中过表达miR⁃488⁃3p 能够下调MMP2 的表达，而抑制miR⁃488⁃3p 则增加MMP2的表达，以上结果表明miR⁃488⁃3p 可能通过调控MMP2 调节滋养层细胞的侵袭和迁移。

综上所述，本研究发现miR⁃488⁃3p 在PE 胎盘组织中高表达，且表达水平与PE 病情严重程度呈正相关；而抑制miR⁃488⁃3p 的表达水平能够显著增强滋养层细胞的侵袭和迁移能力，其机制可能与miR⁃488⁃3p 负向调控MMP2 有关。这将为PE 的发病机制开拓一个新的方向，同时，由于miRNA 本身的保守性，后续可以在PE 动物模型上敲除miR⁃488⁃3p，进一步探索其功能及作用机制，为PE 分子靶向精准治疗提供新的靶点。