施旺细胞去分化在糖尿病周围神经病变中的作用探讨

王家欢 王晓艺 劳国娟 王川 杨川 严励 任萌

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的一种并发症，超过一半的糖尿病患者可能发生糖尿病周围神经病变［1］。神经痛、麻木等症状严重影响患者的生活质量，且糖尿病周围神经病变也是导致糖尿病足截肢率升高的主要原因［2］。髓鞘由施旺细胞包绕轴突形成，髓鞘的绝缘性可介导神经冲动准确而快速的传导，并且在维持轴突的生理特性如轴突运输和轴突直径大小中起重要作用［3］。施旺细胞在病理情况下可以重编程即去分化，参与神经功能的修复再生及病理过程［4］。KROX20是髓鞘蛋白的主要调控因子，KROX20的敲除可引起极速的脱髓鞘及施旺细胞去分化。C⁃JUN及其磷酸化分子是施旺细胞成髓分化的负向调节因子，可拮抗KROX20 的作用，使施旺细胞去分化。信号通路p38 MAPK 及β⁃catenin 在髓鞘发生及神经修复等过程发挥不同的作用，但在糖尿病周围神经施旺细胞去分化的作用尚不明确。本文旨在观察糖尿病周围神经病变的病理改变，探讨施旺细胞去分化在糖尿病周围神经病变发生中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）动物：5 周SD 大鼠8 只，体重约130 g，购自中山大学实验动物中心。（2）主要试剂：KROX20 购自Abcam 公司，C⁃JUN 购自武汉赛维尔生物科技有限公司，p⁃c⁃JUN，p38 MAPK，p⁃p38 MAPK 购 自Cell Signaling Technology 公 司，免 疫 组化试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）糖尿病大鼠模型的建立：SPF 级，5周龄雄性SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分成正常组和糖尿病组，每组4 只。糖尿病组行STZ 65 mg/kg 腹腔注射，1 周后测随机血糖≥16.7 mmol/L认为造模成功。糖尿病模型建立后第8 周，在用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉满意后，收取坐骨神经。（2）坐骨神经电镜观察：坐骨神经用电镜固定液固定，1%锇酸后固定。行环氧树脂包埋，用Leica UC7 超薄切皮机制作60-80 nm 的超薄切片，于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色，6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色。透射电子显微镜HT7800/HT7700 下观察，采集图像分析。每个组织选取5⁃8 个视野，用Image J 软件进行分析。Gra⁃tio=轴突直径/纤维直径。（3）免疫组化：坐骨神经用4%多聚甲醛固定后，行石蜡包埋，切片后常规脱蜡，按相关免疫组化试剂盒说明书进行KROX20的标记。用IRS 评分系统进行分析，IRS= P×I，P 为染色阳性率：P=0，阴性；P=1，1%⁃24% 阳性率；P=2，25%⁃49%阳性率；P=3，50%⁃74% 阳性率；and P=4，75%⁃100% 阳性率。I 为染色强度：I=0，阴性；I=1，弱阳性；I=2，阳性；I=3，强阳性。（4）Western blot 检测蛋白含量：用放射免疫沉淀法提取坐骨神经组织蛋白，电泳前按4∶1 体积比与上样缓冲液混合热变性，约取10 μg 蛋白上样于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转印至PVDF 膜上，封闭1 h，4℃过夜孵育特异性一抗，后与HRP 标记的特异性二抗，室温孵育1 h，ECL 试剂处理曝光。用Image J 软件分析条带光密度。以内参β⁃actin 计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件包处理数据。计量数据以均值±标准差表示，两组独立组均值间采用t 检验，多组均值间采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 糖尿病大鼠的周围神经病变髓鞘的病理改变 电镜结果显示，糖尿病大鼠坐骨神经的髓鞘出现明显的病变。图1A 示糖尿病大鼠神经髓鞘出现明显的肿胀和松解，可见髓鞘脱失，轴突萎缩变性多见于髓鞘损伤严重的纤维。糖尿病大鼠神经髓鞘的G ratio 明显比正常大鼠大，且在轴突直径小的神经纤维中更明显，说明糖尿病大鼠的小纤维更薄，提示髓鞘的再生现象（图1B）；糖尿病大鼠的神经纤维面积明显小于正常组大鼠，且髓鞘面积的比值下降（图1C）。以上结果提示，糖尿病周围神经病变以髓鞘病变为主。

1.2 糖尿病神经病变存在施旺细胞去分化 糖尿病大鼠坐骨神经分化相关蛋白的表达结果显示，髓鞘蛋白调控因子KROX20 在糖尿病神经明显下调。同时，施旺细胞重编程的主要调控转录因子，p⁃C⁃JUN 在糖尿病神经中明显上调（图2），提示糖尿病状态下，施旺细胞出现去分化。

1.3 糖尿病大鼠坐骨神经相关通路的变化 糖尿病大鼠坐骨神经中β⁃catenin 明显上调，wnt 通路的激活；而磷酸化的p38 MAPK 在糖尿病大鼠坐骨神经中明显下调，详见图3。

3 讨 论

3.1 糖尿病大鼠周围神经病变的主要病理改变 本研究结果发现，糖尿病大鼠周围神经病变的病理改变主要是髓鞘肿胀、脱失，髓鞘变薄减少及轴突变性，伴有轻度的髓鞘再生，与人体标本的病理改变相符。也验证了在糖尿病周围神经病变的过程中，施旺细胞出现了去分化现象。髓鞘病变是神经传导速度减弱，麻木等临床症状的主要原因之一［5］。在糖尿病患者神经病变症状轻微时的神经标本发现明显的脱髓鞘，但轴突病变不明显，也有研究认为1 型糖尿病模型轴突病变更为突出，可能与模型建立的时间及方法不同有关［6］。

图1 糖尿病周围神经病变的髓鞘病理改变 A：大鼠坐骨神经髓鞘电镜图（标尺=20 μm）；B：神经髓鞘G Ratio 分析；C：大鼠坐骨神经纤维面积及髓鞘面积分析。*P＜0.05，***P＜0.001

图2 糖尿病状态下，施旺细胞发生去分化 A：Western blot 检测大鼠坐骨神经中KROX20，C-JUN 及p-C-JUN 的蛋白表达水平。B：免疫组化检测大鼠坐骨神经中KROX20 的表达（放大倍数：200×）。*P＜0.05，**P＜0.01

图3 糖尿病大鼠坐骨神经通路改变 Western blot 检测大鼠坐骨神经β-catenin，p38 MAPK 及其磷酸化蛋白的表达水平。*P＜0.05

3.2 糖尿病周围神经病变的髓鞘病变与施旺细胞去分化之间的关系 尚不明确。施旺细胞的去分化主要表现在其成髓能力的下调。KROX20 是促进髓鞘形成及维持髓鞘结构的重要转录因子［7］，其表达下调提示施旺细胞的成髓能力下降和髓鞘结构的不稳定。磷酸化的C⁃JUN 通过拮抗KROX20 的作用，抑制髓鞘蛋白的生成，诱导施旺细胞的去分化。在神经病变早期，神经脱髓鞘及施旺细胞去分化现象并存，提示施旺细胞去分化与脱髓鞘关系密切［8，9］。在多项脱髓鞘疾病模型研究中发现，体内外抑制施旺细胞去分化可改善脱髓鞘的发生［10］。高糖可以直接导致施旺细胞去分化，药物干预后施旺细胞去分化被逆转，脱髓鞘现象有所改善［11］，提示施旺细胞去分化可能导致脱髓鞘。此外，神经损伤修复过程中，施旺细胞去分化导致的脱髓鞘属于正常生理过程［12］，但在糖尿病状态下，神经功能修复发生障碍，施旺细胞异常去分化，可能是糖尿病周围神经病理性脱髓鞘的原因之一。

3.3 糖尿病周围神经病变的信号通路变化 本研究结果显示β⁃catenin 在糖尿病大鼠坐骨神经中呈激活状态，β⁃catenin 信号通路是神经系统十分重要的通路。β⁃catenin 信号通路的激活可通过炎症反应引起脱髓鞘并抑制髓鞘再生［13］。抑制β⁃catenin信号通路可通过减轻内质网应激及炎症因子改善糖尿病周围神经病变［14］。因此，β⁃catenin 通路的激活可能直接引起糖尿病髓鞘病变。促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）在施旺细胞的去分化中起重要作用，p38 MAPK 是神经系统髓鞘形成的正向调控因子［22］。p38 MAPK 可通过调控KROX20 的表达影响施旺细胞的成髓能力［23］。本研究结果显示，糖尿病大鼠p⁃p38 MAPK 及KROX20 表达明显减少，提示糖尿病状态下p38 MAPK 的活性下降引起KROX20 的表达下调而介导施旺细胞的去分化及脱髓鞘。因此，wnt 通路的激活及p38 MAPK 通路的抑制共同作用引起糖尿病周围神经病变。

综上所述，本研究通过建立糖尿病大鼠模型，阐述了糖尿病周围神经病变早期以髓鞘肿胀脱失为主，施旺细胞发生去分化。其病理机制可能与β⁃catenin 及p38 MAPK 通路的改变相关，为糖尿病周围神经病变的机制探讨及临床诊治提供新思路。