腹泻兔病原菌的分离鉴定及耐药性检测

李 昶，刘莎莎

(湖南娄底职业技术学院，湖南娄底 417000)

兔的腹泻病是临床中常见疾病之一，引起兔腹泻的因素很多，病原性因素主要有病毒、细菌、寄生虫、附红细胞体等多种病原，还有饲养管理不当、卫生条件差、饲料突变等非病原性因素。相关研究表明病原性因素引起的腹泻发病率和死亡率均较高，其病死亡率高达70%以上，成为危害兔养殖业主要疾病之一[1-3]。引起幼兔腹泻的病原菌主要有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌等，这些病原菌一旦引起发病，可以波及全群[4]。因此，在家兔养殖中应该重视腹泻性疾病的防控，同时还要注意环境卫生与定期消毒，减少该病的发生与流行。本研究采集发生腹泻的家兔肛拭子、粪便120份病料进行病原菌分离鉴定，并对病原菌致病性和耐药性进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2018年-2019年，采集娄底地区发生腹泻的家兔肛拭子、粪便203份。

1.1.2 主要试剂 琼脂糖胶回收试剂盒、2×TaqMarker Mix，北京天根生化科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000，北京中科瑞泰生物公司产品；含卡那霉素、卵黄的CW琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、大肠埃希氏菌显色鉴别培养基、SS培养基、XLD培养基、70 mL/L绵羊血培养基、MH培养基、厌气肉肝汤培养基、普通营养肉汤，青岛海博生物有限责任公司产品；肠科杆菌生化鉴定试条、药敏纸片，杭州微生物试剂公司产品。

1.1.3 仪器设备 恒温培养箱(DHP-9082),上海鳌珍仪器制造有限公司产品；PCR仪(G5100-6400),美国Agilent Technologie公司产品；凝胶成像系统(GelDocXR+),美国Bio-Rad公司产品；电泳仪(JY600)，北京君意电泳设备有限公司产品；全自动细菌生化鉴定系统，法国梅里埃公司产品。

1.1.4 实验动物 25 g±2.2 g昆明系小鼠290只，临床健康，由遵义市实验小鼠养殖基地提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养 取采集的病料精处理后，一组接种于营养肉汤中增菌，37℃恒温箱12 h～18 h后，分别接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基、XLD培养基、大肠埃希菌显色培养基、SS培养基、70 mL/L绵羊血培养基、MH培养基进行培养；另一组接种于接种厌气肉肝汤增菌培养，37℃厌氧12 h～24 h后，接种于含卡那霉素、卵黄的CW琼脂培养基中厌氧过夜培养。取纯化培养的分离菌株涂片染色。

1.2.2 生化试验鉴定 按照细菌微量生化鉴定管说明书，将菌液接种微量生化鉴定管中培养12 h～24 h，进行生化试验鉴定。

1.2.3 PCR检测与测序 参照文献[5-6]，根据大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌保守区基因序列设计特异鉴定引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取分离菌株基因组DNA，用6种特异性引起进行PCR检测，其 PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，其测序结果NCBI中Blast比对分析其同源性。

表1引物序列

1.2.4 动物致病性试验 参照文献[7-8]，将分离菌株培养至对数期计数，调整菌液浓度1×108CFU/mL，每株分离菌株灌胃攻毒5只小鼠，剂量为0.2 mL，对照组给予PBS。攻毒12 h后，观察7 d，并记录攻毒组小鼠的发病与死亡情况，并进行病原菌鉴定。

1.2.5 药敏试验 参照用美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准KB纸片法进行，按照CLSI的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)进行结果判断，分析耐药性分析。

2 结果

2.1 分离培养结果

疑似大肠埃希氏菌在大肠埃希氏菌显色鉴别培养基长出圆形的、大小一致的绿色的菌落，染色镜检呈两端钝圆杆状阴性菌。疑似铜绿假单胞菌在MH培养基上长出圆形的、大小一致菌落，培养时间过长呈现绿色，染色镜检呈两端略圆的短杆状阴性菌；疑似产气荚膜梭菌在含卡那霉素、卵黄的CW琼脂培养基长出圆形、卵黄色、周围形成白浊环菌落，染色镜检呈两端钝圆、无到芽孢粗杆状阳性菌；疑似金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基上长出边缘整齐的浅黄色菌落，在70 mL/L羊血培养基呈现β溶血，染色镜检呈单个短链和成串状阳性球菌；

2.2 生化鉴定结果

分离的20株分离菌株均能发酵枸橼酸盐、葡萄糖、麦芽糖；吲哚试验呈阴性，鉴定为铜绿假单胞菌；分离的17株分离菌株发酵为麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、硝酸盐还原为阳性，甘露醇、吲哚为阴性，鉴定为产气荚膜梭菌；分离的15株菌株能分解葡萄糖、甘露糖、蔗糖、且产酸不产气，不分解纤维二糖、阿拉伯糖、七叶苷，靛基质试验阴性；V-P试验和过氧化氢酶试验阳性，鉴定为金黄色葡萄球菌；分离的30株均能分解甘露醇、葡萄糖、麦芽糖产酸产气，V-P试验呈阴性、吲哚和甲基红反应为阳性，鉴定为大肠埃希氏菌。

2.3 细菌PCR检测与测序结果

分离菌株用大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌特异性引物各自扩增出约为1 043、200、324、609 bp的目的基因条带，未扩增出沙门氏菌、志贺氏菌目的基因条带(图1)；大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌4种病原菌PCR产物的侧序结果与GenBank库中登录参考株基因序列同源性均大于97.9%。从分子生物学角度证实从203份病料组织中分离得到了20株铜绿假单胞菌、17株产气荚膜梭菌、15株金黄色葡萄球菌、30株大肠埃希氏菌。

2.4 致病性试验结果

在攻毒后的2 d～4 d，攻毒组小鼠精神沉郁，采食量减少，腹泻，部分小鼠肚子鼓胀，有的小鼠无明显临床症状死亡，从死亡的小鼠体内分离到铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌4种病原菌，试验结束(7 d)，对照组的小鼠健康存活。经过统计，分离得到20株大肠埃希氏菌、15株铜绿假单胞菌、12株产气荚膜梭菌、10株金黄色葡萄球菌对小鼠具有致病性。

M.DNA标准DL 2 000；1.空白对照；2.志贺氏菌；3.沙门氏菌；4.金黄色葡萄球;5.铜绿假单胞菌;6.产气荚膜梭菌;7.大肠埃希氏菌

2.5 耐药性分析结果

分离的15株致病性铜绿假单胞菌对阿莫西林、氨曲南、庆大霉素、大观霉素、林可霉素、强力霉素、磺胺嘧啶7种药物耐药率为46.7%～100%，对其他药物耐药率在20.0%～40.0%；分离的12株致病性产气荚膜梭菌对环丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、庆大霉素、大观霉素、林可霉素、多粘菌素、强力霉素8种药物耐药率为41.7%～100%，对其他药物耐药率为8.3%～33.3%；分离的10株致病性金黄色葡萄球菌对磺胺嘧啶、氟苯尼考、庆大霉素、大观霉素、林可霉素、多粘菌素、强力霉素7种药物80.0%～100%，对其他药物耐药率在10.0%～40.0%；分离的20株大肠埃希氏菌对磺胺嘧啶、多黏菌素、强力霉素、阿莫西林、氨曲南、氟苯尼考、庆大霉素、大观霉素7种药物45.0%～100%，对其他药物耐药率在10.0%～40.0%(表2)。

表2耐药性分析结果

3 讨论

家兔养殖过程中，饲养管理不当或者外界条件发生改变时，家兔免疫力下降，其感染病原菌几率会显著增加，当家兔感染病原菌后出现消化道、呼吸道等疾病，严重者可导致死亡，兔细菌性疾病成为危害养兔业主要疾病之一[2-4]。兔细菌性腹泻发病率和病死率均较高，且发病无明显的季节性，以冬春季节最易流行，引起兔腹泻病原菌种类比较多，具有多样性[9-10]。相关研究表明腹泻对幼兔危害比较大，病死率可达50%～70%[11]。因此，在家兔养殖过程中应该注意兔腹泻的防控。本试验采集的发生腹泻病兔肛拭子、粪便等病料120份中分离得到20株铜绿假单胞菌、17株产气荚膜梭菌、15株金黄色葡萄球菌、30株大肠埃希氏菌。通过人工感染小鼠验证其分离菌株的致病性，结果显示，分离菌株对小鼠具有致病性，从而证实了4种病原微生物可能是引起实验家兔腹泻主要病原菌。许国洋等[6]研究表明重庆地区引起兔腹泻的病原菌主要有产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌等，且存在混合感染。大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌均是人畜共患的条件致病菌，广泛存在养殖环境中，当动物机体免疫力下降时，均可以引起发病[12]。因此，在兔养殖过程中应该注重相关细菌性疾病防控及环境卫生与消毒，同时加强平时饲养管理，减少应激反应。

由于引起兔腹泻的病原菌比较复杂，给疫苗的研制带有较大困难，因此，抗菌药物成为控制兔腹泻病的主要手段之一。相关研究表明在动物养殖过程中，不合理的使用抗菌药物，致使沙门氏菌、大肠埃希氏菌、葡萄球菌、链球菌等多种致病菌均对抗菌产生具有很强的耐药性，且出现多重耐药性。同时病原菌产生的耐药性可以通过多种途径传播给人类[13]。本试验研究，分离的15株致病性铜绿假单胞菌对阿莫西林、氨曲南、庆大霉素等7种药物耐药率在46.7%以上，分离的12株致病性产气荚膜梭菌对环丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考等8种药物耐药率在41.7%以上，分离的10株致病性金黄色葡萄球菌对磺胺嘧啶、氟苯尼考、庆大霉素等7种药物耐药率在80.0%以上，分离的20株大肠埃希氏菌对磺胺嘧啶、多黏菌素、强力霉素等7种药物耐药率在45.0%以上，4种病原菌对其他药物具有不同的耐药性。说明从患腹泻病的兔分离的病原菌具有很强的耐药性，应该注重抗菌药物的合理使用，减少耐药性产生。本研究为兔腹泻病的防控提供了科学依据。