猪流行性腹泻病毒纳米抗体融合蛋白真核表达及鉴定

郭 涛，李村院,2，刘开平，李晓悦，胡瑞瑞，李雅心，王小奎，倪 伟*，胡圣伟*

(1.石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度传染性和致死性疾病[1]。其临床症状主要表现为仔猪呕吐、腹泻、脱水以及体重减轻；病理组织学变化主要表现为空肠和回肠肠绒毛萎缩等。PED在冬季和春季极易发生，夏季相对较少，严重时可导致仔猪死亡，以新生2周龄以下仔猪病死率最高(甚至可达到100%)[2]。2010年冬季，我国广东、广西、四川等南方地区先后暴发大规模PED疫情[3]，目前PEDV已经侵袭全球多个国家与地区，尤以欧洲和亚洲最为严重，对养殖业造成了严重的经济损失[4-5]。

PEDV隶属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，基因组为单股正链RNA，全基因组长约28 kb[6]，其结构蛋白主要有糖基化纤突蛋白(S蛋白)、糖基化囊膜蛋白(M蛋白)、RNA结合的未糖基化核衣壳蛋白(N蛋白)、小膜蛋白(E蛋白)。S蛋白位于病毒粒子表面，介导病毒的吸附、融合和侵入宿主细胞等基本生物学功能，通常被认为由S1(1-789 aa)和S2(790-1 383 aa)组成。S1蛋白COE区域(499-638 aa)是诱导机体产生中和抗体的主要抗原，同时，S1蛋白S1D(636-789 aa)区包含1个线性抗原表位(697-742 aa)和2个B细胞表位(744-759 aa和756-771 aa)[7]。因此，S蛋白是研发抗PED药物的重要靶标蛋白。

肠道黏膜免疫所产生的分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体[8-9]，能够在肠道中发挥黏膜免疫作用和清除PEDV的作用，对PED防控具有重要意义。纳米抗体是自然界存在的可与抗原结合的最小片段，具有免疫原性低、稳定性强、亲和力高、组织穿透性强等优点，目前已在基础研究、新药开发和疾病诊治上有广泛研究和应用[10]。纳米抗体因其分子质量小的特性，便于将两个或多个纳米抗体串联，达到识别一个或多个细胞表面受体结合位点效果，可以比针对单一抗原表位的抗体发挥更好的免疫作用。 有研究已成功分离出抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)的纳米抗体，并构建成串联双价单特异性抗体，在治疗类风湿关节炎中展现出了积极的作用[11]。基于PEDV肠道感染的特点和纳米抗体分子质量小的优势，本实验室将两段靶向PEDV的纳米抗体序列串联，并与猪IgA可结晶段(fragment crystallizable，Fc)融合，成功构建了pUC57-NB3-NB6-Fc质粒。本试验探究了NB3-NB6-Fc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，为后期制备PEDV抗体药物和口服饲料提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒E.coliDH5α、毕赤酵母GS115、真核表达载体pPIC9K及pUC57-NB3-NB6-Fc质粒均为动物基因工程实验室保存。目的基因NB3-NB6-Fc序列全长1 488 bp，基因5′末端酶切位点为SnabⅠ，3′末端酶切位点为NotⅠ。

1.1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶SnabⅠ和NotⅠ、Premixed protein marker均为TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均为北京天根生化科技有限公司产品；G418为Sigma公司产品；酵母提取物、胰蛋白胨均为OXOID公司产品；生物素、酵母氮源培养基等常用试剂及TCA浓缩试剂盒、小鼠抗6X His单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，引物合成及测序均由其完成。

1.1.3 仪器设备 Mastercycler pro梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；KS 4000 iC控温摇床，IKA公司产品；蛋白电泳仪、琼脂糖凝胶核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；半干转膜仪，伯乐公司产品。

1.2 方法

1.2.1 NB3-NB6-Fc蛋白生物信息学分析 NB3-NB6-Fc蛋白理化性质由生物信息学工具ExPASyprotparam在线分析完成；二级结构由SOPMA进行预测分析；三维空间构象由Swiss-model进行模拟预测。

1.2.2 毕赤酵母重组表达质粒构建 提取pUC57-NB3-NB6-Fc质粒和酵母表达载体pPIC9K质粒，利用SnabⅠ/NotⅠ在37℃条件下酶切2 h，酶切后进行酶切产物回收和纯化，利用T4 DNA连接酶在16℃、4 h的条件下进行连接，重组为pPIC9K-NB3-NB6-Fc。

1.2.3 毕赤酵母电转化感受态制备 取保存于-80℃冰箱的毕赤酵母GS115甘油菌，划线接种于YPD平板上，30℃培养2 d，挑单菌落于1 mL YPD液体培养基中，30℃、200 r/min～250 r/min振荡培养过夜。转接于100 mL YPD液体培养基中，振荡培养至OD值1.2～1.5，4℃、5 000 r/min离心5 min收集沉淀菌体，用100 mL预冷无菌水洗涤2次，20 mL预冷1 mol/L山梨醇洗涤1次，重悬于200 μL预冷1 mol/L山梨醇中，制得感受态细胞。

1.2.4 重组表达载体的酵母电转化 将1.2.3构建得到的重组表达质粒用SacⅠ酶切使之线性化后，冰上预冷15 min，取3 μg～5 μg，与80 μL酵母电转化感受态细胞混匀，迅速转移入预冷的0.2 cm电转化杯，1 500 V电压刺激5 ms后立即加入800 μL预冷1 mol/L山梨醇溶液混匀，涂布于MD培养基，30℃生长3 d～4 d。待长出阳性单克隆后转涂0.5、1.0、1.5 mg/mL的G418抗生素的YPD固体平板上，培养2 d～3 d，筛选多拷贝重组子。用相同的方法转化空载体作为阴性对照。

1.2.5 重组酵母菌落基因组PCR鉴定 挑取若干个单菌落于2.5 mL YPD液体培养基中，30℃、200 r/min～220 r/min振荡培养过夜，各取500 μL提取酵母基因组，用pPIC9K的通用引物AOX-1进行PCR验证，其中以线性化的重组表达质粒作为阳性对照。引物序列为：上游引物：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；下游引物：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。PCR反应程序为：95℃ 5 min,95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃延伸5 min。用10 g/L琼脂糖凝胶鉴定PCR扩增产物，阳性重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.6 重组酵母菌的诱导表达 活化：挑选若干个经PCR和测序验证为阳性的单克隆菌株，于5 mL YPD液体培养基30℃、220 r/min培养过夜；扩大：分别接种50 μL菌液于15 mL BMGY培养基，30℃、220 r/min培养至菌液OD600nm为2～3；诱导：5 000 r/min离心5 min，弃上清，收集沉淀重悬于15 mL BMMY培养基，29℃继续培养72 h，每12 h加入甲醇至终浓度为8 mL/L；检测：取发酵结束后的菌液1 mL，5 000 r/min离心5 min，取上清，根据TCA浓缩试剂盒方法处理样品，以诱导后的空载体作为阴性对照，进行SDS-PAGE检测。

1.2.7 重组蛋白Western blot鉴定 Western blot进一步验证目的蛋白是否成功表达。蛋白样品经SDS-PAGE后转至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，用小鼠抗6×His抗体作为一抗，37℃孵育2 h，TBST洗涤后再用HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体作为二抗，37℃孵育1 h，TBST洗涤后用DAB显色进行观察。

2 结果

2.1 NB3-NB6-Fc蛋白生物信息学分析

NB3-NB6-Fc蛋白含有496个氨基酸，分子质量约为53.2 ku，等电点为7.58，用ExPASyprotparam计算得到平均疏水性为-0.232，预测该抗体蛋白是亲水性蛋白。通过Swiss-model在线预测NB3-NB6-Fc蛋白的空间结构相对紧密，具有丰富的α-螺旋、β-转角和无规则卷曲结构，β-折叠结构较少(图1)。

图1NB3-NB6-Fc蛋白三级结构预测

2.2 pPIC9K-NB3-NB6-Fc表达载体构建

克隆载体pUC57-NB3-NB6-Fc及pPIC9K质粒经SnabⅠ/NotⅠ双酶切后，回收酶切产物并连接，将连接后的重组质粒转化至E.coliDH5α，提取质粒，酶切验证，在1 488 bp处可见与预期相符的目的基因条带。质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司测序后，经序列比对发现测序结果与预期相吻合，表明pPIC9K-NB3-NB6-Fc载体构建成功(图2)。

2.3 pPIC9K-NB3-NB6-Fc重组酵母菌株筛选与鉴定

pPIC9K-NB3-NB6-Fc质粒经SalⅠ酶过夜酶切，可看到约10 764 bp大小的条带，与预期9 276 bp+1 488 bp相符合(图3A)，表明线性化成功。将线性化的pPIC9K-NB3-NB6-Fc和空载体pPIC9K分别电转化入毕赤酵母GS115后，分别涂布于MD平板上。经不同浓度G418抗生素的YPD固体平板筛选后，挑取7个生长良好的阳性转化子。以重组酵母菌基因组为模板，用AOX-1检测引物进行PCR鉴定。与线性化阳性对照质粒相比，在2 000 bp左右处出现与阳性对照相近的条带，说明重组表达载体的5’AOX1区域与酵母宿主菌的同源序列发生整合，pPIC9K-NB3-NB6-Fc正确插入酵母菌染色体，将重组酵母命名为pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115，空载体重组酵母菌命名为pPIC9K-GS115(图3B)。

M.DNA标准DL 2 000；1.SnabⅠ/NotⅠ酶切鉴定M.DNA Maker DL 2 000；1.Digestion with SnabⅠ and NotⅠ

M.DNA标准DL 2 000；A1.pPIC9K-NB3-NB6-Fc质粒；A2.线性化质粒；B1～B10.pPIC9K-NB3-NB6-Fc质粒；B11.线性化质粒

2.4 NB3-NB6-Fc蛋白表达与鉴定

对PCR鉴定后的1、3、4、6、7、9、10号pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115首先接种在BMGY培养基，培养18 h～20 h后，离心收集菌体，重悬于等量BMMY培养基，29℃甲醇诱导重组蛋白表达。表达产物上清液经TCA浓缩处理后，利用SDS-PAGE进行分离鉴定，结果显示与阴性对照相比，1、2、3、6泳道中在相应大小附近处出现与预测蛋白大小(53.2 ku)相吻合的特异性条带(图4)。

为了进一步确认诱导表达的目的蛋白，使用His标签抗体利用Western blot技术进行了验证。检测结果显示，2、3、4、7泳道在53.2 ku大小附近检测到明显特异性表达条带，再次证实NB3-NB6-Fc蛋白成功分泌表达(图5)。

M.蛋白分子质量标准；1～7.pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115诱导上清；8.pPIC9K-GS115空质粒诱导上清

M.蛋白分子质量标准；1.阳性对照；2～8.pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115诱导上清；9.pPIC9K-GS115空质粒诱导上清

3 讨论

近年来对PED的暴发仍然缺乏有效的防控方案，亚洲地区PED疫情较为严重，除病毒发生变异外，还与猪群免疫力低下有关。PEDV极易感染新生仔猪，2周龄内仔猪感染率可高达90%[12]，且新生仔猪免疫系统发育不完全，母源抗体保护效果有限，依靠疫苗的主动免疫无法提供及时的保护作用[13]，因此开发新型抗PEDV药物对PED的防控有重大意义。

存在于外分泌液(如乳汁、胃肠液等)的SIgA是机体黏膜免疫最重要的抗体，能够抵御呼吸道、消化道、泌尿生殖道中病原体的侵害。由于PEDV具有肠道组织嗜性，主要通过肠道感染机体，因此本试验将PEDV纳米抗体NB3-NB6与IgA Fc段(即铰链区和CH2-CH3区)相连接，既可通过纳米抗体介导免疫细胞吞噬、清除病毒，其Fc段也可识别IgA Fc受体(FcαRI，CD89)[14]，发挥其相应生物学效应，引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)等[15]。有研究筛选出了针对肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)的纳米抗体，与猪sIgA的Fc段拼接融，并与分泌成分(SC)、J链共表达，成功在拟南芥种子中表达了重组的单体VHH-IgA(mVHH-IgA)、二聚体VHH-IgA(dVHH-IgA)以及分泌型VHH-IgA(sVHH-IgA)，将种子掺入饲料中可以产生针对ETEC有效的保护[16]。将2个抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体连接到猪IgG上，得到的双特异性纳米抗体，用药后可以明显减少和延缓口蹄疫发生，甚至可以抑制FMDV的传播[17]。可见，将纳米抗体与免疫球蛋白Fc片段融合的方法已经发展为制备基因工程抗体药物的重要手段。

巴斯德毕赤酵母分泌表达系统是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一，具有操作方便、生长快速和产量高等优点。与原核表达系统相比，最主要的区别是毕赤酵母表达系统可进行外源基因翻译后的加工与修饰，完成蛋白质折叠、二硫键的形成和糖基化等复杂的处理过程，还能够将可溶性、正确折叠的蛋白产物分泌到培养基中。毕赤酵母表达系统已发展成为研究真核蛋白的一种重要手段，广泛应用于蛋白酶、激素、抗体等生物活性蛋白的研究和生产[18-19]。

本试验首先利用生物信息学工具，预测NB3-NB6-Fc蛋白可折叠形成含有多个沟槽的高级结构，有利于与抗原结合，之后将NB3-NB6-Fc基因连接至pPIC9K酵母分泌型表达载体，构建重组质粒pPIC9K-NB3-NB6-Fc并转化入毕赤酵母GS115，筛选得到阳性转化子后，进行了诱导表达，经SDS-PAGE和Western blot分析表明NB3-NB6-Fc融合抗体成功分泌表达。本试验证实NB3-NB6-Fc抗体蛋白能够由毕赤酵母GS115成功分泌表达至培养基中，可减少杂蛋白的影响，也为下游分离纯化和鉴定奠定了良好的基础。后期可探索适宜的摇瓶发酵条件，纯化抗体蛋白并进行功能验证，为未来在抗体药物和口服饲料方向为PED的防控提供材料。