新城疫病毒感染性克隆全长cDNA转录载体的构建

郭承意，仝丽娜，周 雷，李增魁，文 英，刘海金，杨增岐*，高小龙*

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性传染病，能够在鸡和多种禽类中广泛传播，是威胁养禽业的最主要疫病之一[1]。鸡感染后主要临床特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱以及黏膜和皮肤出血。世界动物卫生组织(OIE)将新城疫列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。NDV为不分节段单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Aoulavirus)[2]。NDV基因组由15186、15192或15198个核苷酸组成，全基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经酪氨酸(HN)和大分子蛋白(L)[3]。

反向遗传技术是研究生物基因与性状关系，通过分子生物学技术在DNA水平对遗传物质进行一系列操作(如突变、缺失、插入、替换等)，进而探究基因改变对生物性状的影响。人们已经构建了许多重组病毒，通过对比重组病毒和亲本毒株的差异，阐明了影响病毒毒力、复制能力、抗原位点变异、组织嗜性等许多科学问题[4-6]。NDV重组病毒的研究为后续NDV感染性克隆试验奠定了一定的基础[7]。近年已有多种NDV感染性克隆构建系统，根据全长cDNA转录载体转录时所用启动子不同，可将NDV感染性克隆分为两种，一种是基于T7启动子系统，另一种是巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子系统[8]。根据全长cDNA克隆的方法不同，又可分为传统酶切连接克隆法、不依赖酶切的克隆法(LIC)和合成克隆法。传统的酶切连接克隆法费时费力，且受酶切位点限制；而LIC主要依靠融合技术，相对酶切连接法效率高。为提高载体通用性及提高全长cDNA克隆效率，本研究拟构建一种NDV全长cDNA克隆双启动子转录载体，为简便快速构建NDV感染性克隆奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；SalⅠ、EcoR Ⅴ、BglⅡ、NotⅠ、SacⅠ限制性内切酶购自Thermo Fisher公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自OMEGA公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；Trans 2K Plus DNA Marker，TransStart®Fast Pfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.2 质粒 pCI-neo、pEGFP-N1、pAd-track CMV均为西北农林科技大学杨增岐教授馈赠，由青海大学农牧学院兽医公共卫生实验室保存。

1.1.3 主要仪器设备 梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；核酸电泳设备、凝胶图像成像系统，上海天能科技有限公司产品；倒置荧光显微镜，日本尼康公司产品；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；恒温水浴锅、恒温摇床、恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 linker序列的设计与合成 参照文献[9-11]，设计合成linker基因序列，该序列所含元件分别为“T7P-GGG-HamR-NDV 5′UTR-KpnⅠ-SmaⅠ-NDV 3′UTR-HdvR-T7 termi-SV3-NotⅠ”；设计好的序列由江苏金唯智公司合成，合成的linker序列装载于pUC57载体上。序列详细信息如下：

1.2.2 引物设计 参考pCI-neo、pEGFP-N1、pAd-track CMV载体的序列，分别设计扩增编码GFP和Kan基因的引物，引物由江苏金唯智公司合成(表1)。

1.2.3GFP和Kan基因片段的获得 以pEGFP-N1质粒作为模板，GFP-F和GFP-R为引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通过PCR扩增获得GFP基因片段。PCR扩增体系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1.5 μL，pEGFP-N1质粒0.2 μL，用无酶ddH2O补足50 μL。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，预期条带大小1 000 bp，胶回收1 000 bp左右的目的条带，即为GFP基因片段。

以pAd-track CMV质粒为模板。以Kan-F和Kan-R为引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通过PCR扩增获得Kan基因片段，加样体系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1.5 μL，pAd-track CMV质粒 0.2 μL，用无酶ddH2O补足50 μL。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 40 s，62℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，预期条带大小2 800 bp，胶回收2 800 bp左右的目的条带，即为Kan基因片段。

表1引物信息

1.2.4GFP和Kan基因片段的融合 以1.2.3中回收的GFP和Kan基因片段为模板，通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan融合基因片段，PCR加样体系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，引物GPF-F 1.5 μL，引物Kan-R 1.5 μL，回收的GFP基因片段1 μL，回收的Kan基因片段5 μL，用无酶ddH2O补足50 μL。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 40 s，55℃40 s，72℃ 1.5 min ，35个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，预期条带大小3 800 bp，胶回收目的条带，即为GFP-Kan融合基因片段。

1.2.5 pCI-GFP/Kan载体构建BglⅡ和SalⅠ双酶切pCI-neo载体和胶回收的GFP-Kan融合基因片段。酶切体系分别如下：①BglⅡ 0.5 μL，SalⅠ 0.5 μL，pCI-neo质粒4 μL，10×bufferO 2 μL，无酶ddH2O补足20 μL；②BglⅡ 0.5 μL，SalⅠ 0.5 μL，GFP-Kan融合片段9 μL，10×bufferO 2 μL，无酶ddH2O补足20 μL。37℃，酶切2 h。酶切产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，回收①中1 000 bp和②中3 800 bp左右的目的条带。

用T4 DNA连接酶连接pCI-neo酶切后1 000 bp条带与GFP-Kan酶切后3 800 bp的条带。连接体系如下：10×T4 ligasebuffer 1 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，pCI-neo酶切产物3 μL，GFP-Kan基因酶切产物1.5 μL，无酶ddH2O补足10 μL。16℃连接过夜。次日将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化产物涂布卡那抗性LB平板，挑选平板上的阳性克隆做酶切鉴定。

1.2.6 pCI-GFP/Kan载体鉴定 酶切鉴定正确的载体送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan。为进一步验证构建的pCI-GFP/Kan载体上CMV启动子能否正常工作，取2 μg pCI-GFP/Kan转染BHK21细胞，参照LipofectamineTM2000试剂说明书进行细胞转染。转染36 h后，于荧光倒置显微镜下观察荧光，并设立pEGFP-N1为阳性对照，未转染空细胞为阴性对照。

1.2.7 pCI-infect载体构建 用SacⅠ和NotⅠ双酶切pUC57-Linker和pCI-GFP/Kan，体系为①SacⅠ 0.6 μL，NotⅠ 0.6 μL，10×tango buffer 4 μL，pUC57-Linker 5 μL，无酶ddH2O补足20 μL；②SacⅠ 0.6 μL，NotⅠ 0.6 μL，10×tango buffer 4 μL，pCI-GFP/Kan 4 μL，无酶ddH2O补足20 μL。37℃酶切2 h，酶切产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，回收①中3 800 bp和②中800 bp的目的条带进行连接，连接体系如下：10×T4 ligase buffer 1 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，pCI-GFP/Kan酶切回收产物1 μL，pUC57-Linker酶切回收产物2.5 μL，无酶ddH2O补足10 μL。16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，转化产物涂布卡那抗性LB平板，挑选平板上的阳性克隆做酶切和测序鉴定，鉴定正确的重组载体命名为pCI-infect。

2 结果

2.1 GFP和Kan基因片段的扩增结果

以pEGFP-N1质粒为模板，用GFP-F和GFP-R为引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通过PCR获得1 000 bp左右的GFP条带(图1)。胶回收1 000 bp的目的条带，即为GFP基因片段。以pAd-track CMV质粒为模板，用Kan-F和Kan-R为引物，在Pfu DNA聚合酶作用下扩增出2 800 bp左右的目的条带(图2)。胶回收此2 800 bp的目的条带，即为Kan基因片段。

2.2 GFP-Kan基因片段的融合扩增

以上步回收的GFP和Kan基因片段为模板，以GFP-F和Kan-R为引物，通过Overlap PCR扩增获得3 800 bp的GFP-Kan融合基因片段，同时在1 000 bp～2 000 bp和大于5 000 bp处有2条非特异性条带(图3)。胶回收3 800 bp目的条带，即为GFP-Kan融合基因片段。

2.3 pCI-EGFP/Kan载体构建与鉴定

用BglⅡ和SalⅠ限制性内切酶双酶切pCI-neo质粒和GFP-Kan融合片段，切出1 000 bp和3 800 bp的目的条带(图4)。胶回收1 000 bp左右的pCI-neo酶切条带以及3 800 bp左右的GFP-Kan酶切条带，进行连接和转化，转化产物涂布卡那抗性LB平板，挑取平板上长出的阳性克隆，摇菌后抽提质粒。抽提的4个克隆的质粒用EcoRⅤ进行单酶切和测序鉴定，显示序列均正确，重组载体命名为pCI-GFP/Kan。为确定构建的pCI-GFP/Kan载体中CMV启动子可否正常工作，用2 μg pCI-GFP/Kan转染BHK-21细胞后36 h于倒置显荧光微镜下观察(图5)，结果表明CMV启动子可以正常工作。

M.DNA标准DL 5 000；1～2.GFP基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.GFP amplified products

M.DNA标准DL 5 000；1～2.Kan基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.Kan amplified products

M.DNA标准DL 5 000；1～2.GFP/Kan基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.GFP/Kan amplified products

M.DNA标准DL 5 000；1～2.pCI-neo载体双酶切；3～4.GFP/Kan基因片段双酶切

A.pCI-GFP/Kan; B.pEGFP-N1; C.Negative control

2.4 pCI-infect载体构建

用SacⅠ和NotⅠ双酶切pCI-GFP/Kan和pUC57-linker载体(图6)，切出3 800 bp和800 bp的目的条带。胶回收3 800 bp和800 bp的目的条带。将回收的条带用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，培养后挑取平板上的克隆，摇菌提取质粒后用SacⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，切出800 bp和3800 bp目的条带(图7)。进行测序后，显示序列均正确，表明pCI-infect构建成功。

M.DNA标准DL 5 000；1～2.pCI-GFP/Kan双酶切；3～4.pUC57-linker双酶切

M.DNA标准DL 5 000；1.pCI-infect双酶切M.DNA Marker DL 5 000; 1.Double enzyme digestion of pCI-infect

3 讨论

本研究为提高载体通用性，采用了双启动子系统，在反义基因组5′端同时设计了CMV和T7启动子，在CMV和T7启动子之间添加了intron，避免相互干扰。同时为了提高T7启动子转录效率，在T7启动子后添加了3个G[11]。转录后的病毒基因组RNA序列5′和3′末端的精确性对病毒拯救至关重要[12]，为使病毒cDNA转录时能产生无任何冗余序列的精确5′末端和3′末端，提高拯救效率，在linker设计时在NDV 5′UTR和3′UTR区分别添加了58 bp的锤头状核酶(HamR)序列和89 bp的丙型肝炎病毒核酶(HdvR)序列元件，保证转录出精确的病毒RNA末端序列。

由于真核细胞RNA聚合酶一般位于细胞核中，在构建伯尔纳病毒感染性克隆微基因组时，在微基因组末端添加了衍生于猴病毒40(SV40)的SV3入核信号序列，显著提高了微基因组拯救效率。利用Ⅱ型RNA聚合酶构建感染性克隆时，相比于SV40早期多聚腺苷酸化信号，在HdvR后添加SV40晚期多聚腺苷酸化信号可显著提高cDNA转录效率[13]。本研究为保证后期cDNA获得较高的转录效率，在反义基因组3′末端HdvR序列后添加了SV3元件和SV40晚期多聚腺苷酸化信号。

载体的大小和抗性对全长cDNA克隆构建也有影响，本研究中载体大小由最初的5.4 kb(pCI-neo)变为4.6 kb(pCI-infect)，易于后期NDV全基因克隆；为与常用的Amp抗性载体加以区分，避免污染和易于筛选，在构建中将pCI-neo载体上的Amp抗性替换为Kan抗性。但在融合Kan基因片段和GFP基因片段时，除扩增出3 800 bp大小的预期条带外，还出现两条非特异性条带(图3)，一条非特异性条带大于5 000 bp，另一条非特异性条带大小为1 000 bp～2 000 bp，经优化退火温度和PCR反应体系，上述两条非特异性条带仍存在，但非特异性条带与3 800 bp的目的条带通过琼脂糖凝胶电泳可加以区分，且经切胶、回收克隆和测序后，显示GFP-Kan基因片段正确。本研究构建了一种NDV全长cDNA克隆双启动子转录载体，为简便快速构建NDV感染性克隆积累了材料。