猪肉和鸡肉中11种同化激素残留超高效液相色谱-串联质谱法测定

张家华，方炳虎，王敏儒*

(1.佛山科学技术学院，广东佛山 528000；2.华南农业大学，广东广州 510642)

同化激素是一类具有强的蛋白质同化作用，可抑制异化或氧化代谢，提高蛋白质沉积的甾体类物质，具有重要的残留毒理学意义。在养殖业滥用最普遍的主要有睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等[1-2]。由于它们能提高饲料转化率和瘦肉生产率，一些从业者在利益驱使下将其用作畜禽的促生长剂[3]。雄性激素可损害人的肝功能，影响心血管系统，伤害人体的生殖系统，引起内分泌功能障碍等，过量摄入性激素还可能对青少年的神经系统和心理行为发展造成不可逆转的损害[4-6]。原农业部发布的第178号公告明确指出不得在动物饲料和饮食中添加苯丙酸诺龙等药物[7]。但目前非法将这类药物用于畜禽、水产养殖上的报道仍时有发生。

国内外主要采用液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法检测动物组织中的睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等同化激素[8-13]。目前我国对于上述11种同化激素在猪肉、鸡肉中的多残留检测报道相对较少，参考现有的行业标准(农业部1031号公告-1-2008[14])，本研究在参考文献基础上对仪器参数和样品前处理条件进行优化，拟建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),以期能够同时测定鸡肉、猪肉中睾酮等11种同化激素，为批量检测样品中睾酮等违禁药物的残留量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 睾酮、甲睾酮、群勃龙、诺龙、美雄酮、丙酸诺龙标准品，德国Dr．Ehrenstorfer公司产品；勃地龙，美国CATO公司产品；丙酸睾酮、康力龙、黄体酮，中国食品药品检定研究所产品；苯丙酸诺龙标准品，美国IL公司产品。

1.1.2 试剂 甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，德国Merk公司产品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、无水乙醇均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱系统，美国安捷伦公司产品；Triple QuadTM4500液质联用仪，AB SCIEX公司产品，配Analyst1.6.3软件；CPA225D电子天平，赛多利斯科学技术仪器(北京)有限公司产品；ST16R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司产品；JE1002电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产品；R205B旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司公司产品；N-VEVAP 24位氮吹仪，美国Organomation公司产品；MS3普通型旋涡混合器，广州仪科实验技术有限公司产品；Milli-Q Reference超纯水系统，Merck Millipore公司产品；WAT200677固相萃取装置，Waters公司产品；Agilent C18固相萃取小柱(200 mg，3 mL)，美国安捷伦公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 同化激素标准储备溶液配制 准确称取睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙10 mg(按实际含量折算，精确至0.0001)置于10 mL容量瓶中，用纯甲醇溶液溶解并稀释，配成1 mg/mL标准储备溶液，置-20℃下保存。

1.2.1.2 同化激素混合标准中间液的配制 从配制好的同化激素标准储备液中，各自取1.0 mL的同化激素标准储备液，甲醇定容至20 mL，配制成50 μg/mL的混标储备液，置-20℃下保存。用甲醇稀释备用。

1.2.2 色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液；柱温：37℃；进样体积：5 μL；流速：0.25 mL/min；梯度洗脱程序:0 min～1 min,30%～55% A；1 min～3 min,55% A；3 min～6 min,55%～98% A；6 min～12 min,98% A；12 min～12.5 min,98%～30% A；12.5 min～15 min,30% A。质谱条件：电喷雾电离(ESI)，正离子扫描，多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压(IS)5500V，雾化气压力(GSl)65 psi，辅助器流速(GS2)60 L/rain，气帘气压力(CUR)30 psi，离子源温度(TEM)550℃，碰撞室压力(CAD)8 psi。去簇电压、碰撞能量及定量离子对、定性离子对等参数见表1。

表1目标化合物的多反应监测质谱参数

1.2.3 样品测定

1.2.3.1 样品制备 将鸡肉、猪肉的可食用组织部分尽可能地去除筋膜和脂肪后，切成小块，用绞肉机绞碎，置-20℃下保存备用。

1.2.3.2 样品提取 精确称取2 g(精确至0.001 g)匀浆好的组织于50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL 甲醇-乙腈(1∶1，v/v)，涡旋混匀，超声提取10 min，以6000 r/min 离心10 min。将上清液转移至50 mL 聚丙烯离心管中，重复提取一次。合并提取液，置-20℃下，冷冻2 h。以10000 r/min，离心10 min。

1.2.3.3 样品净化 将“1.2.3.2”中提取的上清液于37℃水浴旋转蒸至近干，加4 mL 30%乙腈水溶解，备用。将上述溶液加到C18固相萃取柱净化(3 mL甲醇、3 mL水活化，6 mL 30%甲醇水淋洗)，抽干后，加入4 mL乙腈洗脱，置-20℃下冷冻1 h。以15000 r/min，离心10 min。于37℃水浴下氮气缓慢吹干。加入1 mL 30%乙腈复溶，涡旋2 min，上清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3.4 检测限与定量限的测定 分别制备0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 μg/kg的添加样品，每个浓度重复3次，前处理后。经UPLC-MS/MS检测，从基质添加样品中检测待测物质的最小浓度为检测限(limit of detection，LOD)，被定义为信噪比S/N≥3。根据其检测限以同样的方法确定其定量限，基质添加样品中被测物能被定量测定的最低量为定量限(Limit of Quantitation，LOQ)，被定义为S/N≥10。

1.2.3.5 标准曲线的制作 准确称取空白样品7份，进行前处理，制备空白基质液。将混合标准储备液用初始流动相稀释成1000、500、200、100、50、20、10 ng/mL的标准工作液。取空白基质液对上述标准工作液进行稀释，制得浓度为100、50、20、10、5、 2、1 μg/kg的空白基质匹配标准溶液，每个浓度重复3次，共做3个批次。

1.2.3.6 回收率与精密度 准确称取2 g(精确至 0.001 g)空白基质，添加适当浓度的混合标准工作液 100 μL，制备成10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的添加浓度。每个添加浓度做5个重复，连续做3个批次，添加提取剂进行提取，其他按照上述前处理方法进行处理。同时制得10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg的空白基质匹配标准溶液，采用单点定量法，按照回收率计算公式计算各添加水平下的回收率。每组5个平行样品回收率之间的相对标准偏差是批内精密度(RSD)，3个批次的添加样品回收率之间的相对标准偏差是批间精密度(RSD)。

2 结果

2.1 液相条件

试验中采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，可实现对11种同化激素激素类药物的分离，药物的没有拖尾现象，且峰形对称，图1为11种同化激素在猪肉中的MRM离子流色谱图。

2.2 方法线性范围、检出限和定量限

在1 μg/kg～100 μg/kg浓度内，猪肉和鸡肉中各个药物基质匹配标准曲线线性关系良好(R2>0.99)。按照方法规定进行前处理，上机测定。在猪肉中，睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙的检测限和检出限分别为0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。鸡肉中，睾酮、甲睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙的检测限和检出限分别为0.1 μg/kg～0.5 μg/kg和0.3 μg/kg～1 μg/kg。

图111种同化激素在猪肉中的MRM色谱图(10 μg/kg)

2.3 回收率和精密度

为消除或减少基质效应的影响，按照“1.2.3.6”方法，采用空白样品添加标准溶液进行检测，猪肉中11种药物平均回收率为74.3%～101.1%，批间变异系数为6.0%～13.7%。鸡肉中11种药物平均回收率为70.1%～97.4%，批间变异系数为5.0%～12.3%。

2.4 实际样品检测

将建立的方法应用于鸡肉、猪肉各20个实际样品的检测，均未检出睾酮等11种同化激素。

表2检出限与定量限

3 讨论

3.1 仪器条件选择

3.1.1 MS/MS特征离子的选择 对于动物肌肉组织中多种甾体激素的分析，采用串联质谱MRM模式采集信号。在ESI+电离方式下，11种甾体激素都可形成稳定的[M+H]+准分子离子峰，然后进行相应的子离子全扫描,以确定MRM特征诊断离子，11种甾体激素选择的特征离子见表1，每种药物选择两个离子对。

3.1.2 液相条件的优化 基于超高效液相色谱分离的特点和要求，在优化的流动相条件下，11种甾体激素药物在 15 min内实现良好的分离，峰形对称，不拖尾，图1为11种激素在猪肉中的MRM离子流色谱图。考虑到同化激素容易受到内源性干扰，选用的色谱柱不宜过短，因此选择了长度为150 mm的色谱柱。11种同化激素在温度高于45 ℃时易于分解，而色谱柱温度较低时分离洗脱效果较低，且出峰较慢。流动相中加入适量的甲酸溶液有利于11种激素都可形成稳定的[M+H]+准分子离子。试验对比了有机溶剂乙腈/甲醇(A相)与水/0.1%甲酸水溶液(B相)分离目标化合物的效果。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流动体系中，采用梯度洗脱，可实现 11种甾体激素药物的快速分离，且峰形良好。

3.2 样品前处理方法优化

3.2.1 除脂 动物组织含有的脂肪会影响检测方法的灵敏度，本研究对比了使用乙腈饱和的正己烷和低温冷冻两种方法以及两种方法相结合的除脂效果。当使用乙腈饱和的正己烷进行除脂，结果表明丙酸睾酮和丙酸诺龙的回收率均低于30%，而苯丙酸诺龙几乎检测不到，且其余8种药物的回收率相对于用冷冻除脂的方法也有所降低，因此选择冷冻除脂。

3.2.2 提取溶剂的选择 试验对比了叔丁基甲醚、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等溶剂或混合溶液的提取效果，发现叔丁基甲醚提取时，康力龙、丙酸睾酮、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙的回收率低于30%。乙酸乙酯提取时，康力龙、苯丙酸诺龙的回收率低于55%。以甲醇-乙腈(1∶1，v/v)提取时各个药物的回收率较高，且易于浓缩，最终选择甲醇-乙腈(1∶1，v/v)作为提取液。

3.2.3 固相萃取法的优化

3.2.3.1 固相萃取柱的选择 考虑到经有机试剂提取肌肉组织容易得到较多杂物，本试验采用最常用的净化方式固相萃取净化。由于类物质为中等极性或者弱极性，目前报道中[8-13]多采用MCX、HLB和C18固相萃取小柱。本试验对比了11种同化激素在MCX、HLB和C18两种固相萃取小柱上吸附效果，当使用 MCX 柱进行净化时，大部分药物的回收率低于30%。与HLB固相萃取柱相比，各个药物在C18固相萃取柱上回收率均较高，同时考虑其成本相对较低，最终选择C18柱。

3.2.3.2 淋洗液的选择 在固相萃取过程中，需要尽可能地洗掉的干扰组分，且需保证所测目标化合物不被洗脱下来。本试验所测目标化合物易溶于甲醇，选用的固相萃取柱的淋洗溶剂一般采用甲醇，因此，本研究采用加入含所测药物混合标准溶液的空白样品进行试验，选择不同浓度的甲醇水作为淋洗溶液，比较淋洗效果。试验结果表明，当淋洗液为20%甲醇水淋洗的目标化合的回收率相对较高，30%甲醇水淋洗液的回收率稍偏高；另外，随着甲醇的含量增加，即甲醇含量高于30%时，目标化合物未被固相萃取柱保留而导致回收率降低。主要原因由于目标化合物能溶解于有机试剂甲醇中，在淋洗过程中，随着甲醇的含量的增加，其洗脱的能力也增加，因此，造成目标化合物在淋洗过程中被冲洗，造成了回收率的降低，最终选取30%甲醇作为淋洗溶液。

3.2.3.3 洗脱液的选择 本试验选用甲醇、乙腈及混合溶剂甲醇/乙腈(1∶1，v/v)对目标化合物进行洗脱。试验结果表明，在洗脱剂用量不变的条件下，甲醇与乙腈的洗脱能力相当，乙腈稍高于甲醇的洗脱能力；而当选择甲醇作为洗脱液时，群勃龙和勃地龙的回收率相对于乙腈洗脱时低，且杂质增多；以混合溶剂甲醇/乙腈(1∶1，v/v)对目标化合物进行洗脱时，洗脱速度相对较慢，杂质也相对较多，因此，最终选择乙腈溶液作为最佳洗脱溶剂。

表3猪肉和鸡肉中11种同化激素的线性方程

表4猪肉和鸡肉中11种同化激素的回收率与精密度

本试验对洗脱溶剂乙腈不同洗脱体积(2 mL，3 mL，4 mL，5 mL)对目标化合物的洗脱能力，试验结果表明，当洗脱液体积为2 mL 时，整体目标化合物的回收率较低；当升高洗脱溶剂至3 mL 时，其回收率相对增加；当采用5 mL洗脱液体积时，回收率有降低的趋势；洗脱液的体积与氮吹浓缩的时间有关，故在一定程度上影响了前处理的时间。因此，考虑回收率与经济实惠等因素，最终选定4 mL洗脱液体积为最佳选择。

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱测定11种同化激素的方法，以猪肉、鸡肉为检测基质，证明了方法的可应用性，为肉品中同化激素的检测提供了可选择的方法。