H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

张盼涛，盛东北，张 亚，田 辉，段佳蕾，刘武杰，田克恭

(国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471000)

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为低致病性禽流感病毒，是家禽常见的病毒之一[1]。H9N2亚型AIV虽不会导致家禽高发病率和高病死率，但可引起鸡上呼吸道感染，产蛋率下降，损害鸡免疫系统，引起其他病原的继发感染[2]。H9N2亚型AIV不仅影响养禽业的发展，同时也威胁人类公共卫生安全。1998年以来已有多例H9N2亚型AIV感染人的报道，这也加快了全球对该亚型禽流感病毒的研究[3-4]。H9亚型禽流感灭活疫苗有效控制了该病的流行，然而，疫苗免疫失败的现象时有发生，在活禽市场中依然能够检测到大量的H9N2亚型AIV。引起该现象的原因是其HA基因不断发生变异，造成现有疫苗保护力下降[5-7]。本研究从安徽合肥某鸡场分离到1株H9N2亚型禽流感病毒HF株，免疫攻毒保护试验表明该毒株具有良好的免疫原性，为了验证由该毒株制备的灭活疫苗对当前流行毒株的保护效果，筛选2018年和2019年各2株H9N2亚型流行毒株对免疫HF株灭活疫苗和商品化疫苗的SPF鸡进行攻毒保护试验，评估HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫攻毒保护效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 10株H9N2亚型禽流感病毒株，包括HF株、A181877-2018株、A181878-2018株、A182078-2018株、A182096-2018株、A190194-2019株、A190543-2019株、A190759-2019株、A190854-2019株和A191001-2019株，来源于河南、湖南、山西、江西、安徽、山东6个省份，均由国家兽用药品工程技术研究中心分离、鉴定、保存。

1.1.2 疫苗 将HF株经灭菌生理盐水稀释至10-3，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL，37℃孵育96 h，收获鸡胚尿囊液，用终浓度为2 mL/L的甲醛溶液灭活病毒，灭活后进行HA效价测定、无菌检验及灭活检验，检验合格后按照油相∶水相为1∶2的体积比乳化制苗，并对疫苗成品进行性状与无菌检验；某企业商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(批号：01171226)。

1.1.3 SPF鸡和SPF鸡胚 SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司；SPF鸡购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 生物安全柜(BHC-1300 Ⅱ A/B3)，上海苏净实业有限公司产品；生物安全型隔离器(GJ-1)，苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HA基因遗传进化分析 对HF株及其他分离株的HA基因进行测序，用MEGA6软件进行遗传进化分析，并根据遗传进化分析结果选取代表毒株进行攻毒保护试验。

1.2.2 鸡胚半数感染量(EID50)测定 将HF株及选取的代表毒株用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释，取10-7～10-10稀释度的病毒液，经尿囊腔接种10日龄～11日龄SPF鸡胚，0.1 mL/枚，每个稀释度接种5枚，37℃培养120 h ，逐胚测定HA效价，HA效价大于1∶16判定为阳性，参考Reed-Muench方法计算出病毒EID50。

1.2.3 分组与免疫 3周龄SPF鸡，共100只，其中1～8组每组10只，第1～4组腿部肌肉免疫H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗，第5～8组肌肉免疫商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，均为0.3 mL/只。剩余20只分为4组，5只/组，为攻毒对照组。

1.2.4 采血与攻毒 免疫3周后，各试验组鸡只采血并分离血清，用H9亚型禽流感病毒HF株制备的HI抗原检测HI抗体效价。同时进行攻毒保护试验，攻毒试验共分为12组，1～4组为HF株灭活苗免疫组；6～8组为商品化疫苗免疫组；9～12组为对照组。采血当天进行攻毒，疫苗免疫组与对照组攻毒毒株为A181877-2018、A182096-2018、A190543-2019、A191001-2019，静脉注射，0.2 mL/只(含107.0EID50)。

1.2.5 病毒分离 攻毒后连续观察14 d，至第5天时，分别采集每只鸡的喉头及泄殖腔拭子，将同一只鸡的喉头及泄殖腔拭子混合后作为1个样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2 mL，孵育观察120 h，逐胚测定鸡胚尿囊液的HA效价。每个拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚液的HA效价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。

2 结果

2.1 HA基因遗传进化分析

选取2018年H9亚型禽流感病毒分离株4株、2019年H9亚型禽流感病毒分离株5株，与HF株一起进行HA基因的遗传进化分析。结果显示，包括HF株在内的10株分离株均属于当前流行毒株所属的h9.4.2.5谱系，综合考虑毒株的分离时间、地点、亲缘关系及区域流行情况，本研究选取2018年和2019年分离的A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株、A191001-2019株作为代表毒株进行攻毒保护试验(图1)。

2.2 病毒株EID50测定

经测定，HF株、A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株和A191001-2019株每0.1 mL的病毒含量依次为109.2EID50、108.4EID50、108.4EID50、108.5EID50和108.7EID50，对应的HA效价依次为9 log2、9 log2、8 log2、8 log2和8 log2。

表1H9亚型AIV流行毒株攻毒保护结果

2.3 HI抗体测定和攻毒试验结果

试验鸡以0.3 mL/只免疫HF株灭活疫苗，3周后其HI抗体效价可达9.1 log2～9.5 log2；以同样剂量免疫商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗后，其HI抗体效价为5.7 log2～6.3 log2，两者抗体滴度存在3 log2的差异，表明HF株灭活疫苗相较于商品化疫苗能诱导鸡体产生更高水平的HI抗体滴度，具有更好的免疫原性(表1)。

对相同条件下的免疫组和空白对照组鸡分别攻毒4株分离株(107.0EID50/0.2 mL/只)，所有鸡只在攻毒后14 d观察期内均无任何临床症状，精神状况、采食良好，无全身和局部不良反应。采集攻毒后第5 d鸡的喉头及泄殖腔拭子，接种鸡胚检测排毒情况，计算病毒分离阳性率和攻毒保护率。结果显示，4组空白对照组鸡攻毒后拭子分离均为阳性，排毒率均为100%(5/5)；HF株疫苗对A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株病毒的攻毒保护率均为100%(10/10)，对A191001-2019株的攻毒保护率为90%(9/10)；商品化疫苗对A181877-2018株、A182096-2018株、A190543-2019株、A191001-2019株病毒的攻毒保护率分别为60%(6/10)、70%(7/10)、60%(6/10)、40%(4/10)。以上结果表明，以HF株为抗原制备的灭活疫苗相较于商品化疫苗，更能保护免疫鸡抵抗当前流行毒株的攻击，具有更好的免疫保护效果(表1)。

▲分离株，●商品化疫苗代表株▲ isolate strains,●commercial vaccine represent strains

3 讨论

疫苗株与流行毒株间的基因同源性和抗原差异性决定了疫苗对流行毒株的保护效果[8]，不同时期、不同地点分离的H9亚型AIV相较于前几年有一定程度的变异[9-10]。因此，需要评估不同禽流感病毒株的抗原性，从而筛选具有良好保护效果的疫苗株。毒株之间的交叉攻毒保护试验是筛选疫苗候选株最可靠的办法[11]。本研究根据HA基因的遗传进化分析结果筛选攻毒用流行毒株，结果表明HF株及9株H9N2亚型禽流感病毒分离株的HA基因均属于当前流行毒株所属的h9.4.2.5谱系[12-13]。 2007年之后，我国H9亚型AIV流行主要以A/Chicken/Guangxi/55/2005类的病毒为代表的h9.4.2.5分支为主[14]。综合考虑毒株的分离时间、地点、亲缘关系及区域流行情况，选取2018年和2019年各2株分离株进行攻毒保护试验。

将研制的禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡，3周后采血测定HI抗体效价，结果发现HF株灭活疫苗相较于商品化疫苗能诱导鸡体产生更高水平的HI抗体滴度，具有更好的免疫原性。以107.0EID50的剂量分别静脉注射4株代表流行毒株后，免疫HF株灭活疫苗的鸡总攻毒保护率接近100%。本研究中，分离自2015年的HF株制备的灭活疫苗能够保护免疫鸡抵御2018年-2019年H9N2亚型禽流感流行毒株的攻击，具有良好的免疫原性，HF株是当前预防H9N2亚型禽流感良好的疫苗候选株。