异丙酚对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移及JAK2/STAT3通路的影响

苏 凯，杨彦楠，杨欣刚

胶质瘤亦称神经胶质瘤，是颅内最常见的恶性肿瘤，年发病率为4/10万～5/10万，具有恶性程度高、治愈率低、预后差等特点[1,2]。目前,手术治疗是最直接、有效的治疗方式，但患者近5年整体生存率仍低于10%[3]。因此，寻找一种安全有效的方法成为临床上亟待解决的问题。近年来，保护神经元免受损伤和诱导胶质瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭能力成为治疗胶质瘤的突破口。异丙酚又称丙泊酚或普鲁泊福，是临床常用的静脉麻醉药，具有起效快、苏醒迅速、分布快、持续静注后无蓄积等特点。最新研究证实，异丙酚有一定的神经保护作用，可通过抗氧化、抗炎、抗凋亡等不同机制减轻脑缺血再灌注后神经元损伤，发挥器官保护作用[4-6]。Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路是细胞因子激活相关的信号转导通路，有研究表明JAK2/STAT3信号通路可参与神经元的增殖、生存、分化过程，参与中枢神经系统紊乱疾病中的炎性反应病理过程，与脑缺血等中枢神经系统疾病关系密切[7，8]。但异丙酚能否影响胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移及调控JAK2/STAT3信号通路还尚未研究。本研究拟通过用MTT法、Transwell模型、划痕实验和Western blotting法研究异丙酚对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移及JAK2/STAT3通路的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 异丙酚注射液购自美国Sigma公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶、青链霉素双抗购自美国Gibico公司；MTT试剂、Transwell板、Matrigel购自美国Sigma公司；兔抗人JAK2、兔抗人STAT3、兔抗人p-JAK2、兔抗人p-STAT3、兔抗人内参β-Actin、羊抗兔二抗购自美国Bioworld公司。SC-Y408A光学显微镜购自深圳市晨晟光学仪器有限公司；Thermo赛默飞世尔FC酶标仪购自美国ThermoFisher公司；BPH-9042细胞培养箱购自苏州诺微尔电子科技有限公司；细胞培养接种专用超净台购自郑州安晟科学仪器有限公司；电泳槽和转膜槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养 胶质瘤U87细胞购自上海信裕生物工程有限公司；人正常星型胶质细胞HEB购自上海奥陆生物科技有限公司。将胶质瘤U87细胞和人正常星型胶质细胞HEB按常规培养在含有10%血清、1%青链霉素双抗的DMEM培养液中，在37 ℃、5%CO2、相对湿度98%的培养箱中培养，隔天换液，长至80%时传代，收集对数期细胞用于实验。

1.3 细胞增殖能力检测 取对数生长期的胶质瘤U87细胞、人正常星型胶质细胞HEB，用培养液将细胞密度调整为5×104个/ml，以每孔200 μl接种到96孔板，继续培养过夜后弃培养液，并用PBS清洗3遍，加入浓度为5、10、25、50、100 μM的异丙酚培养液，每组设置6个副孔，同时设置只加0.1%DMSO组，不加异丙酚的对照组。培养箱培养48 h，之后加入MTT溶液(5 mg/ml)25 μl，继续培养4 h，弃去培养液，加入150 μl DMSO溶液，37 ℃，100 r/min震荡10 min，使用全自动酶标仪测定在490 nm处吸光度(optical density，OD值)。计算不同浓度异丙酚对U87细胞和HEB细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4 细胞侵袭能力检测 将Matrigel从-20 ℃冰箱中取出，置于4 ℃条件下过夜解冻，用无血清的培养液稀释至200 μl/ml，之后涂抹到transwell板的滤膜上面(200 μl/cm2)，37 ℃放置3 h，取出后在超净台上干燥过夜。取对数生长期的胶质瘤U87细胞，用无血清的培养液将细胞密度调整为1×105个/ml，以每孔200 μl接种到transwell上室，下室加入600 μl含10%血清的培养液，37 ℃，5%CO2培养，待细胞贴壁后更换上室培养液，设置对照组和2、5、10 μM异丙酚组。培养48 h，用棉签轻轻擦去Matrigel和上室内细胞，10%甲醛溶液固定15 min，用蒸馏水清洗3次，0.1%结晶紫染色10 min，蒸馏水清洗3次，每组设置6个副孔。显微镜下拍照，随机选择6个视野计数，结果取平均值。用穿过滤膜的细胞数相对于相应孔中细胞数比例表示细胞的侵袭能力。

1.5 细胞迁移能力检测 取对数生长期的胶质瘤U87细胞，用培养液将细胞密度调整为5×104个/ml，以每孔2 ml接种到6孔板，置于培养箱中，待细胞单层平铺70%～80% 时，用无菌的200 μl枪头垂直于孔底，均匀划出细胞划痕，之后用PBS清洗除去细胞碎片，加入经处理过的无血清培养液。实验组加入含终浓度分别为2、5、10 μM异丙酚的培养液，对照组培养液不经任何处理，每组设置6个副孔，48 h后用倒置显微镜观察细胞的迁移程度并拍照，迁移能力按下式计算：迁移能力(%)=(初始两侧距离-观察时两侧距离)/初始两侧距离×100%。

1.6 Western blot检测 蛋白印迹法(western blotting，WB)测定胶质瘤U87细胞JAK2和STAT3表达情况，设置对照组和实验组(2、5、10 μM异丙酚分别作用U87细胞48 h)。用细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组细胞蛋白含量，每组设置六个副孔。每个点样孔加入50 μg蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离目标蛋白,根据目标蛋白大小：JAK2(130 ku)，p-JAK2(125 ku)，STAT3(86 ku)，p-STAT3(92 ku)剪切大小适当的凝胶。将凝胶上的蛋白以湿转法转至PVDF膜上，使用5%的脱脂奶粉封闭膜上结合位点1 h。加入兔抗人JAK2(1∶1000)、兔抗人STAT3(1∶1000)、兔抗人p-JAK2(1∶1000)、兔抗人p-STAT3(1∶1000)、兔抗人内参β-Actin(1∶1000)4 ℃孵育过夜，用PBS清洗3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗(1∶1000)，25℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，用显色剂ECL显色、曝光。用凝胶成像设备观察。

2 结 果

2.1 生长抑制作用 MTT法测定不同浓度异丙酚处理48 h后，与对照组相比，5、10、25、50、100 μM异丙酚均能显著抑制胶质瘤U87细胞增殖，并具有浓度依赖性，异丙酚对胶质瘤U87细胞作用48 h的半数抑制浓度(IC50)为45.06 μM。与人正常星型胶质细胞HEB组相比，同浓度下异丙酚对胶质瘤U87细胞抑制率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 不同浓度异丙酚作用48 h后对U87细胞和HEB细胞生长抑制率

2.2 体外侵袭和迁移能力的影响 与对照组相比，胶质瘤U87细胞经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后，通过Matrigel到达滤膜底层的细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着异丙酚浓度的增大，其侵袭能力也随着降低。与对照组相比，胶质瘤U87细胞经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后，迁移能力分别降低(19.69±2.67)%、(41.41±3.28)%、(59.75±2.91)%，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 不同浓度异丙酚对U87细胞体外侵袭和迁移能力的影响

2.3 JAK2/STAT3通路的影响 与对照组相比，经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后的胶质瘤U87细胞中JAK2、STAT3蛋白表达水平无明显变化，JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 不同浓度异丙酚对U87细胞JAK2和STAT3表达水平的影响

3 讨 论

目前，胶质瘤是预后最差的恶性肿瘤之一，放化疗耐受、浸润生长、复发是患者死亡的主要原因[9]。如何能有效抑制胶质瘤侵袭、迁移和复发成为当前的研究热点之一，研究表明多种信号通路分子参与胶质瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭过程，促进胶质瘤细胞与胞外基质相互作用，可以分泌基质降解酶，导致正常脑组织局部降解，形成侵袭生长[10，11]。

异丙酚是一种对细胞免疫功能无损伤的静脉麻醉药，具有脂溶性高、清除迅速的特点。研究表明异丙酚能够增强T淋巴细胞的活性，经异丙酚处理后的肿瘤细胞，其增殖、侵袭、迁移能力明显受到抑制[12]。异丙酚能够显著上调miR-218的表达水平，下调MMP-2蛋白表达水平，抑制人胶质瘤U373细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡[13]。张永强等[14]研究发现，异丙酚可通过下调MMP-2蛋白表达水平来抑制肺癌癌细胞的增殖、侵袭，具有潜在的临床应用价值。文献[15]发现，异丙酚同样可调节其他信号通路作用于癌细胞，可能通过阻止P13K/AKt信号通路的激活，抑制人肝癌细胞的侵袭能力。闵娜等[16]发现，异丙酚能够抑制人肝癌细胞增殖、侵袭能力，可能是通过阻止Wnt/β-catenin信号通路的激活而发挥抗肿瘤作用。本研究发现，胶质瘤U87细胞与不同浓度异丙酚共同孵育48 h后，与对照组相比，5、10、25、50、100 μM异丙酚均能明显抑制胶质瘤U87细胞增殖，半数抑制浓度(IC50)为45.06 μM，与人正常星型胶质HEB细胞组相比，同浓度下异丙酚对U87细胞抑制率显著升高，说明异丙酚在5～100 μM浓度范围内能够抑制胶质瘤U87细胞增殖，且对人正常星胶质HEB细胞无毒性。

本研究MTT实验显示，10 μM异丙酚作用48 h后对胶质瘤U87细胞抑制率为(17.31±2.08)%，细胞活力超过80%，为防止细胞活力过低导致Transwell侵袭实验和细胞划痕实验出现假阳性结果，后续选取异丙酚浓度2、5、10 μM进行实验。本研究体外侵袭实验表明，与对照组相比，胶质瘤U87细胞经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后，能够通过Matrigel到达滤膜底层的细胞数明显减少，说明10 μM异丙酚能够抑制脑胶质瘤U87细胞体外侵袭能力。进一步迁移实验表明，与对照组相比，胶质瘤U87细胞迁移能力明显降低，说明10 μM异丙酚能够抑制胶质瘤U87细胞体外迁移能力。异丙酚能够抑制胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移，但具体通过何种细胞信号通路进行调控还待进一步研究。

JAK/STAT信号通路分别由JAK蛋白家族和STAT蛋白家族组成，是体内重要的细胞信号传导途径，可在细胞增殖、分化、凋亡、炎性反应等病理过程中发挥重要作用，研究表明，JAK2/STAT3信号通路与脑缺血再灌注损伤炎性反应相关[17]。脊髓神经受损会大量分泌IL-6，同时激活JAK2/STAT3信号通路，引起促炎因子、NO、诱导型活性氧簇释放。郭佳培等[18]研究表明，青蒿素能够阻断JAK2/STAT3激活诱导肝癌细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用，随后胡兵等[19]研究发现阻断JAK2/STAT3信号通路激活可抑制鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力。本研究结果显示，与对照组相比，经2、5、10 μM异丙酚处理48 h后的胶质瘤U87细胞中JAK2蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平均明显下调，呈浓度依赖效应，说明经异丙酚处理可能抑制胶质瘤U87细胞JAK2蛋白、STAT3蛋白磷酸化，从而阻断JAK2/STAT3信号通路激活。

综上所述，异丙酚可能通过阻断JAK2/STAT3信号通路激活，进而抑制胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移。但异丙酚与JAK2/STAT3信号通路作用机制有待进一步研究。