稻瘟病生防细菌的筛选及其防效测定

孙正祥，郑通文，毛国庆，刘璐，陈东，周燚

1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025 2.湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心(长江大学)，湖北 荆州 434025

水稻是世界上第三大粮食作物，仅次于小麦和玉米，养活了世界上超过50%的人口，其食用价值至关重要[1]。由稻梨孢(Magnaporthegrisea)侵染引起的稻瘟病是世界范围内危害水稻最严重的病害之一，已蔓延至80多个国家，平均每年造成的产量损失可达30%[2]。该病害易突发、流行快，防治难度大。目前,用于防治稻瘟病的措施主要包括农业防治、抗病育种和化学防治，农业防治虽有效但费时费力；抗病育种难度大、周期长，且品种抗性易丧失；化学防治会导致病原菌产生抗药性，且造成环境污染，危害人体健康[3]。生物防治安全有效且可持续，具有良好的发展潜力。

目前报道的稻瘟病生防菌主要有芽孢杆菌属(Bacillusspp.)和假单胞杆菌属(Pseudomonasspp.)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)[4]、坚强芽孢杆菌(B.firmus)[5]、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)[6]和荧光假单胞菌(P.fluorescens)[7]，这些菌株具有良好的室内防效，但其田间防效不理想，且难以直接应用。因此，筛选更多更优质的稻瘟病生防细菌意义重大。研究从对节白蜡(FraxinushupehensisChiu，ShangetSu)及其根际分离筛选对稻瘟病菌(M.grisea)具有较强拮抗作用的细菌，测定其离体叶片防效、盆栽防效和产胞外酶活性，以期为稻瘟病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试稻瘟病菌由长江大学植物与微生物互作研究室分离与保存；供试水稻品种为丽江新团黑谷(感病品种)；供试培养基有PDA培养基、NB培养基[8]、燕麦片培养基[9]、羧甲基纤维素钠培养基[10]、脱脂牛奶培养基[10]、铬天青培养基[10]和几丁质酶检测培养基[10]。供试对照药剂为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，由河北省保定市科绿丰生化科技有限公司生产。

1.2 稻瘟病菌拮抗细菌的分离纯化

于长江大学农学院植物园内选取2株长势良好的对节白蜡，挖取适量根部组织，并收集根际土，将根组织和根际土分别装在采样袋中带回实验室备用。根际细菌的分离：取10g根际土，加入90mL无菌水振荡悬浮，随后进行梯度稀释，取适量的10-6、10-7、10-8稀释液分别涂布于NA平板[11]。对节白蜡内生菌分离：称量1g的根组织，表面消毒后，于无菌研钵中充分研磨，将研磨液梯度稀释，取适量的10-4、10-5、10-6稀释液分别涂布于NA平板。将上述的NA平板置于28°C培养箱中，2d后挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落于新的NA平板上进行划线培养，所得菌株斜面保存备用。

1.3 稻瘟病菌拮抗细菌的筛选

初筛：采用平板对峙法[12]筛选稻瘟病菌的拮抗细菌，28°C培养5d，记录具有抑菌活性的菌株编号。

复筛：参照王宇婷等[13]的平板打孔法检测初筛所得菌株对稻瘟病菌的抑制作用，不同之处是利用无菌打孔器在距离平板中央2cm处三点对称打孔，每孔注入20μL供试菌株的菌液。待对照平板中病原菌菌丝即将长满全皿时，测量各处理的病原菌菌落半径，并计算其抑菌率[14]。

1.4 稻瘟病菌拮抗细菌的离体叶片筛选

选择长势一致的水稻植株(4～5叶期)采集叶片，用无菌剪刀剪成5cm长的片段，经次氯酸钠消毒后平均分为4组，分别进行如下处理：待测细菌发酵液+稻瘟病菌、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂+稻瘟病菌、NB培养液+稻瘟病菌、待测细菌发酵液。

将待测菌株接种至NB培养基中，28°C、130r/min培养48h，利用分光光度计将发酵液浓度调至光密度D600nm为1.0，备用。稻瘟孢子悬浮液的制备：将活化的稻瘟病菌接种至燕麦培养基上，28°C培养7d后每皿加入5mL无菌水洗脱分生孢子获得悬浮液，并用血球计数板将分生孢子的浓度调至1.0×106cfu/mL，向悬浮液中加入0.1%吐温20[15]，备用。

将叶片浸泡于待测菌株发酵液中，处理30min后置于铺有2层湿润滤纸的培养皿中，用无菌牙签轻刺叶片表面，每段叶片刺伤3个点，在每个点上滴加稻瘟病菌孢子悬浮液5μL，然后将培养皿封口置于温室(25°C，光照时间∶黑暗时间=16h∶8h)中。以浸泡于枯草芽孢杆菌菌剂溶液为阳性对照，以浸泡于NB为阴性对照，每个处理3次重复，含水稻叶段18个。3d后参照沙月霞等[16]的方法调查各处理稻瘟病的病情严重度，并计算相应的病情指数和防效。

1.5 拮抗细菌对稻瘟病的盆栽防效测定

挑选健康、饱满的水稻种子浸泡24h，置于28°C培养箱中保湿催芽，露白后播种于装有无菌泥土的塑料盆中，21d后移栽于塑料桶中，每桶栽种7株。试验分为3个处理：拮抗细菌悬浮液+稻瘟病菌、枯草芽孢杆菌可湿性粉剂+稻瘟病菌、NB培养液+稻瘟病菌。

拮抗细菌悬浮液和稻瘟病菌孢子悬浮液的制备参照1.4，每处理含有0.02%吐温80表面活性剂[17]。选取分蘖末期长势一致的水稻，喷施拮抗细菌悬浮液，至叶片向下滴水为止，24h后喷施病原菌孢子悬浮液。以喷施NB培养液为对照，每7d喷施1次，连续喷施2次，每处理4次重复。第二次喷施药剂后7d参照沙月霞等[18]的方法调查各处理叶瘟的病情严重度，并计算相应的病情指数和防效。

1.6 稻瘟病菌拮抗细菌产胞外酶活性测定

选择对稻瘟病防效较好的菌株，检测其产胞外酶活性。拮抗菌株产蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和嗜铁素的活性测定均参照陈思宇等[10]的方法进行，分别测定相应的透明圈或晕圈大小并计算平均值，实验重复3次。

1.7 稻瘟病菌拮抗细菌的鉴定

选择拮抗作用较强的菌株进行分子生物学鉴定。使用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取拮抗细菌的DNA，采用16S rDNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)进行PCR扩增[19]。取少量PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物送至擎科新业生物技术有限公司测序。将所得序列分别在NCBI核酸数据库采用BLAST程序进行同源性搜索比对，通过MEGA 7.0软件构建系统发育进化树。

1.8 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行方差分析，检验组间差异显著性，数据表示为平均数±标准差。

2 结果与分析

表1 稻瘟病菌拮抗细菌的来源和相对抑菌率

图1 菌株YZU-S033和YZU-S061对稻瘟病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 on M. grisea

2.1 稻瘟病菌拮抗细菌的分离和筛选

从对节白蜡及其根际共分离获得193株细菌，通过筛选得到7株对稻瘟病菌有抑制作用的菌株，其中根际细菌YZU-S033和YZU-S061的拮抗能力较强，抑菌率分别为75.47%和73.30%(见表1、图1)。

2.2 稻瘟病菌拮抗细菌的离体叶片筛选

筛选出的7个菌株在离体叶片试验中均能减轻稻瘟病的发病程度，其中菌株YZU-S033和YZU-S061对稻瘟病的防效最好。对照水稻叶片的病情指数为60.5，而经菌株YZU-S033和YZU-S061处理的水稻叶片病情指数分别为11.1和18.5，其防效分别为81.7%和69.4%，明显优于枯草芽孢杆菌菌剂的防效(61.5%)(见表2、图2)。选择菌株YZU-S033和YZU-S061进行后续实验。

(a)稻瘟病菌+NB；(b)稻瘟病菌+枯草芽孢杆菌可湿性粉剂； (c)稻瘟病菌+YZU-S033；(d)稻瘟病菌+YZU-S061； (e)YZU-S033；(f)YZU-S061。 图中红色箭头标注的是稻瘟病病斑。 图2 菌株YZU-S033和YZU-S061对稻瘟病的离体叶片防效Fig.2 Control effects of YZU-S033 and YZU-S061 on rice blast in detached leaf assay

表2 不同菌株对稻瘟病的离体相对防效

2.3 拮抗细菌对稻瘟病的盆栽防效测定

盆栽试验结果显示，对照组水稻的病情指数为24.2，经菌株YZU-S033和YZU-S061处理后的水稻病情指数分别为7.3和8.7。2个菌株对稻瘟病的防效分别为69.8%和64.0%，与对照药剂防效相当(见表3)。

2.4 拮抗细菌产胞外酶活性测定

菌株YZU-S033和YZU-S061均能产生蛋白酶和纤维素酶，其降解圈的直径均大于10mm，但二者均不产生几丁质酶(见表4、图3)。此外，菌株YZU-S061还能分泌嗜铁素。

表3 2株拮抗菌株对稻瘟病的盆栽相对防效

表4 菌株YZU-S033和YZU-S061产胞外酶活性测定结果

图3 菌株YZU-S033和YZU-S061产胞外酶活性Fig.3 Extracellular enzyme activity of strain YZU-S033 and strain YZU-S061

2.5 菌株YZU-S033和YZU-S061的鉴定

BLAST结果显示，菌株YZU-S033和YZU-S061的序列均与贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)Y9的序列具有99%的相似度。系统发育树显示，2个菌株都和贝莱斯芽孢杆菌在同一分支上(见图4)，初步鉴定菌株YZU-S033和YZU-S061均为贝莱斯芽孢杆菌。

图4 基于菌株YZU-S033和YZU-S061的16S rDNA序列及其相似序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 and their homologous sequences

3 讨论与结论

目前国内外已有不少关于筛选和利用拮抗细菌防治稻瘟病的报道[8，20，21]，但这些菌株大多来源较为单一，难以发挥稳定的生防作用。对节白蜡是我国特有的一种药用植物，其生长过程中鲜有病虫害发生，有研究表明这可能与其自身产生的活性物质有关[22]，而这些物质可能来自其内生细菌或根际细菌。研究从对节白蜡及其根际分离筛选稻瘟病菌的拮抗菌，获得拮抗效果较好的细菌2株，其抑菌率均在70%以上，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

沙月霞等[23]分离得到的贝莱斯芽孢杆菌E69对稻瘟病菌具有良好的平板抑制效果，其盆栽防效可达83.24%。笔者研究结果与之相似。菌株YZU-S033和YZU-S061在离体叶片试验中对稻瘟病的防效分别为81.7%和69.4%，对稻瘟病的盆栽防效为69.8%和64.0%。与离体叶片防效相比，盆栽防效略微偏低，可能原因是接种病菌后水稻培养时间偏短，导致稻瘟病发病程度较轻。

拮抗细菌分泌的多种胞外酶均可破坏植物病原真菌菌丝的细胞壁，使病原菌无法完成菌丝生长、孢子萌发等代谢过程，从而达到预防植物病害的目的[24]。此外，拮抗细菌可通过产生和利用嗜铁素，与环境中的病原微生物竞争铁离子，使其因缺乏铁元素而无法正常生长和繁殖，从而控制植物病害的发生[25]。研究中，菌株YZU-S033和YZU-S061产生蛋白酶和纤维素酶的能力较强，其中菌株YZU-S061还可分泌嗜铁素，说明产生胞外酶和嗜铁素是其生防作用机制之一。

研究还筛选得到了2株对稻瘟病具有良好防效的菌株，并对其机制进行了初步研究。然而，这2株拮抗细菌对稻瘟病的田间防效还有待进一步研究。此外，后续研究还将探讨其定殖性和抑菌活性物质的产生等特性，为拮抗菌株的开发应用提供更多的实践基础。