硝酸盐还原菌提高原油采收率研究进展

佘跃惠，胡琳琪，曾琦，顾永安，张凡

1.长江大学石油工程学院，湖北 武汉 430100 2.非常规油气省部共建协同创新中心(长江大学)，湖北 武汉 430100 3.中国地质大学(北京)能源学院，北京 100083

原油资源的枯竭，全球能源需求的增加，当前原油低位的不可预测的价格，以及主要油田的成熟度不断提高，因此需要研究成本更低和更环保的提高原油采收率技术。采用当前技术，可通过一次采油方法采出油藏中20%～40%的原油，二次采油方法可进一步采出15%～25%的原油。因此，多达约55%的原始油残留在储层中而未被采出。三次采油过程涉及应用不同的热力、化学和微生物过程，以经济上可行的速度从不良和衰竭的油井中采收额外7%～15%的原油地质储量(original oil in place，OOIP)[1]。提高采收率可以显著影响原油生产，因为即使采收率提高很小的幅度，也可以带来巨大的收益，而无需开发非常规油气资源。微生物强化采油(microbial enhanced oil recovery,MEOR)是一种有吸引力的接替采油方法，该方法有可能采收高达50%的残余油。在MEOR过程中原位生产生物表面活性化合物不需要大量的资金投入，也不受全球原油价格的影响。与其他EOR(enhanced oil recovery)方法相比，MEOR可以是一种更经济和更环保的选择，因而在最近10年得到快速发展[1-4]。

近年来，微生物诱导产生生物碳酸钙(microbial induced calcium carbonate precipitation，MICP)或者微生物自修复水泥(microbial self-healing concrete，MSHC)成为材料和环保领域的热点研究课题，天然环境包括深部地层广泛存在MICP过程，包括CO2地质埋藏和页岩油气开发等[5，6]。厌氧条件下硝酸盐还原能强化油气藏的MICP过程，并通过提高注入水波及效率这个途径来提高原油采收率[7]。

硝酸盐还原菌(NRB，也称反硝化菌)抑制硫酸盐还原菌(SRB)产硫化氢(H2S)技术，也称生物竞争排斥技术，在国外油气藏得到大量应用，被石油行业广泛认可[8-10]。注入硝酸盐将地下油藏的微生物群落从主要的SRB变为富含NRB的微生物，包括直接氧化H2S的硝酸盐还原硫化物氧化细菌(NR-SOB)。此外，NRB都能通过产生硝酸盐还原途径中形成的亚硝酸盐来促进抑制SRB。NRB的脱氮能力是众所周知的，其中硝酸盐或亚硝酸盐被转化为含氮气体。该功能使NRB在全球氮循环和缓解及控制由硫化物引起的海上油田储层变酸问题中发挥重要作用[9,10]。最近，在研究油藏硝酸盐/亚硝酸盐的注入过程中涉及NRB-SRB相互作用的详细微生物机制时，发现NRB在还原硝酸盐时，也能产生生物表面活性剂，因而能降低油水界面张力，促进原油乳化，易被微生物降解，改善油藏岩石润湿性，再加上硝酸盐还原时产生的氮气和二氧化碳可以增加油藏压力，解除近井地带生物硫化物堵塞，这种多功能效应能有效提高油气采收率[9]。下面，笔者将对NRB的这种多功能特性和硝酸盐还原介导的提高原油采收率技术进行详细介绍。

1 油气藏硝酸盐还原菌资源分布

纯培养和分子生物学方法表明NRB广泛分布在石油油藏中，能以烃类及其代谢产物为碳源和能源，厌氧代谢硝酸盐而生长[11-16]。油藏酸化的处理和修复策略之一是硝酸盐处理，目前在海上油田得到广泛应用[14-16]。项目组成员近5年来，在吐哈、青海和江汉等多个油田，开展地面污水站和油井井下NRB抑制SRB产H2S的现场试验，取得了非常好的效果。在注入水中添加硝酸盐可通过4种机制抑制储层酸化[15]。硝酸盐处理机制之一是刺激NRB生长，由于NRB和SRB(可还原硝酸盐和硫酸盐)使用相似的有机组分作为电子供体，因此NRB可以在碳源利用方面胜过SRB；硝酸盐处理的第2种机制是使SRB的代谢途径从硫酸盐还原转变为硝酸盐还原；硝酸盐处理的第3种机制是刺激NR-SOB生长，NR-SOB利用硝酸盐或亚硝酸盐将硫化物氧化成元素硫或硫酸盐；硝酸盐处理的第4种机制是硝酸盐还原产物(如亚硝酸盐)对SRB的抑制作用。

在油藏本源NRB研究中，比较有意思的是TSESMETZIS等[17]通过油藏岩心中本源微生物分析表明NRB是原位油藏中主要的功能菌。TSESMETZIS从东南亚一个未开发海上油田探井中，使用油基钻井液钻探采集的岩心样品，研究了高温(温度95℃)非水驱油藏中本源微生物菌群，在无菌条件下尽量排除污染，从每个岩心内部提取DNA，并通过对16SrRNA基因进行测序来推导岩心本源微生物群落分布情况。结果表明草酸杆菌科是最主要的科(丰度31.4%±16.6%)。在土壤和水样中普遍发现草酸杆菌科的几个属，以有氧降解芳香烃；在厌氧条件下还原硝酸盐[18]。第二丰富的是假单胞菌科(丰度22.3%±7.9%)。已知该科包含的种能够好氧或厌氧降解多环芳烃(PAH)。据报道，在厌氧条件下，许多假单胞菌种使用硝酸盐或氯酸盐作为首选电子受体[19]。丰度排名第三的细菌科是丛毛单胞菌(丰度10.1%±2.8%)。该科包含需氧和兼性厌氧细菌，它们能够在需氧条件下和厌氧条件下降解单芳烃(BTEX)。已知其许多丛毛单胞菌种在厌氧条件下还原硝酸盐和氯酸盐[20，21]。

从低温稠油油藏中，以石油烃作碳源和能源，硝酸盐作电子受体，也分离到2类厌氧NRB，表明NRB在高温和低温油藏中都普遍存在[21,22]。这些主要微生物类群的代表种都能在厌氧条件下降解碳氢化合物并使用硝酸盐作为末端电子受体。从油藏地层水的化学分析中，表明含有高质量浓度低分子量的有机酸盐(如乙酸盐质量浓度1308mg/L，丙酸盐质量浓度177mg/L，丁酸盐质量浓度34mg/L)，说明油藏中存在高活性的原位厌氧降解石油烃代谢活动。如果这些主要的微生物是油藏储层中固有的，并且没有被油基钻井液污染，它们可能对硝酸盐注入以控制油藏变酸显示出相对快速的响应，说明油藏本源NRB的存在，在存在硝酸盐作为电子受体的情况下，NRB的性能将明显优于SRB，并能防止储层变酸。相反，在这些岩心样品中只检测到了极少量的SRB(丰度<0.01%)，测得的H2S浓度接近零，这表明该油藏条件不利于SRB的生长。但是，在不添加硝酸盐的情况下，注入富含硫酸盐的海水后，情况可能会迅速发生变化，这也可以解释为何很多海上油田注海水后，或者陆上油田清水和污水混注，能刺激SRB快速生长，产生硫化氢而使油藏变酸。

目前关于油藏岩心中微生物研究的报道很少，尽管该岩心中微生物群落结果与文献中结果无可比性，但各种证据表明该非水驱高温油藏的硝酸盐还原可能是一个重要的原位过程，只是由于缺乏营养物和硝酸盐电子受体，硝酸盐还原菌菌体含量很低。相反，尽管地层水中硫酸盐含量适中，但微生物特征表明硫酸盐还原活动却很低。如果检测的微生物特征反映了储层的原位微生物群落，则表明硝酸盐还原可能会在比以前认为的更高温度下发生。该项研究尽管存在很多疑问和不足(如没有开展岩心中的古菌研究)，但是关于岩心中本源微生物的研究还是非常有意义，建议今后加强类似研究，加深人们对油藏本源微生物的认识。

2 硝酸盐还原菌介导选择性封堵

ZHU等[23]研究了一种独特的方法，基于自生生物矿物沉淀改变储层岩石孔隙通道，提高水力和体积波及效率。该方法由厌氧无机营养硝酸盐还原-Fe2+氧化微生物Acidovoraxebreus(nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing，NDFO)介导，在厌氧条件下，以硝酸盐作为唯一的电子受体，氧化可溶性亚铁离子(Fe2+)，生成不溶性铁氧化物矿物沉淀[24]。这种稳定的生物矿物沉淀填充孔隙，减少岩石基质孔喉直径，降低高渗透区的渗透率，使注入水均匀分布。

NDFO过程伴随氮气产生。在该研究中，在处理的模拟柱中观察到氮气小气泡的产生。由于氮气在油中的混溶性，能降低原油的黏度。此外，就地生产氮气增加油藏的驱动压力，从而使原油易于流动。因为廉价和无腐蚀性，氮气已经长期被成功地用作注入流体提高采收率，以及广泛用于油藏压力保持和气体举升[25]。在油藏高压下，氮气与原油能形成可混相的段塞，这有助于从油藏岩石中驱替原油。该研究代表传统微生物提高采收率方法的一个新的方向，并表明硝酸盐还原-Fe2+生物氧化改善体积波及效率，以及提高原油采收率的巨大潜力。

MARTIN等[27]报道兼性厌氧菌Halomonashalodenitrificans在厌氧和高压(8MPa)下,利用硝酸盐还原诱导产生碳酸钙沉淀，能固结地层砂，降低高渗透层渗透性，结果与之前报道的在厌氧常压下产生的碳酸钙沉淀类似，用来封堵裂缝和稳定固结页岩气压裂地层支撑剂，说明油藏在高温高压下，也能实现硝酸盐还原诱导碳酸钙沉淀封堵高渗透层。DOPFFEL等[7]在德国北部油田进行短期和长期(10-160d)注硝酸盐控制油藏酸败提高原油采收率时，发现脱铁杆菌也能产生铁和钙质沉淀。砂岩模拟柱试验表明，产生的生物沉淀会明显降低砂岩渗透率。虽然油藏中的矿物沉淀会随着时间的推移降低储层渗透性，造成严重的注入问题，但由于渗透性较高的通道流量减少，导致原油产量增加，原位产生矿物沉淀可能是改善液流方向的方法。MICP是微生物活动的副产品，在自然地质环境中起着重要的金属共沉淀和固结作用，在土壤加固、二氧化碳地质埋藏和微生物提高原油采收率中具有广泛用途[3-6]。

尽管已经研究了油藏环境高压下的MICP过程，通过模拟试验评价了以改善波及效率为目的的提高原油采收率效果，地下固结岩层裂缝的矿场试验也取得了成功。但是，还需要全面调查原位油藏中能诱导产生生物沉淀或导致生物矿化的本源微生物分布及其生物活性，加强各类油藏高温高压高盐度下的模拟驱油效果研究，结合微生物产生胞外多糖(exopoly saccharides，EPS)增加MICP强度，降低微生物营养物的成本，提高驱油效率。

3 硝酸盐还原菌产生的生物表面活性剂

MULLIGAN等[27]和RODRIGUES等[28]研究注硝酸盐刺激油藏本源NRB生长，抑制SRB和修复油藏酸败时，提出该过程中有可能产生生物表面活性物质，以提高油溶性碳源(原油)利用率，促进NRB快速生长，提高NRB对SRB的生物竞争能力。FALLON等[29]发表的专利证实天然的NRB能产生生物表面活性剂。作为能够利用碳氢化合物作为碳源和能源的微生物，NRB将产生的生物表面活性剂作为副产物，以促进疏水性烃类底物的降解[30]。NRB产生的生物表面活性剂增加了疏水性水不溶性底物的表面积,并增加了其溶解度，从而提高了NRB对烃类化合物的生物利用度。当在NRB的细胞表面附近产生乳状液时，每个细胞簇都会形成自己的微环境，并刺激NRB在油气藏中的生长[30]。

HUI等[31]使用依赖于培养和不依赖于培养的方法，对来自浅层、中温和低盐度大庆油田陆上油藏的3种采出水样品中的微生物群落结构和功能进行了研究。首次分离到多功能恶臭假单胞菌BBAL5-01，能代谢硝酸盐，产生生物表面活性剂和生物聚合物，这表明厌氧本源NRB具有在油层中生产生物表面活性剂的能力，并且具有提高原油采收率的巨大潜力。

FAN等[32]从海上油藏采出的油水样品中筛选出5株产生物表面活性剂的NRB菌，所有菌株都被鉴定为施氏假单胞菌，并研究了它们在以葡萄糖或甘油介质为碳源和能源时的产生物表面活性剂能力。其中施氏假单胞菌 CX3在葡萄糖或甘油培养基上生长时，分别将培养基表面张力降低至33.5mN/m和29.6mN/m。将CX3菌株进一步接种以检测其生长代谢硝酸盐的能力，在2种培养基中进行228h的监测后，硝酸盐消耗量分别为32.4%和94.5%。通过薄层色谱、带火焰离子化检测器的气相色谱仪(FID)和傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对施氏假单胞菌CX3生成的生物表面活性剂产物进行组成分析。经鉴定，生物表面活性剂产物为一小部分脂肽和一大部分糖脂的混合物，其临界胶束浓度(CMC)低至35mg/L。 产生的生物表面活性剂在很宽的温度(4～121℃)，pH(2～10)和盐度(0～0.2g/mL)范围内都显示出高稳定性。

油藏本源的NRB普遍存在，注硝酸盐控制油藏酸败在海上油田已得到广泛应用，但关于NRB抑制SRB的分子机理还有待深入研究。最近关于NRB产生物表面活性剂的研究[9,31，32]，表明NRB在抑制SRB产硫化氢的同时，能产生物表面活性剂促进菌体自身生长，提高对SRB竞争能力，并且对于降解油溶性烃类碳源和提高原油采收率具有巨大应用潜力。今后的研究要加强产生物表面活性剂的NRB单菌提高原油采收率的模拟试验研究，特别关注在模拟油藏高温、高压和高盐度环境下的生存竞争能力和提高原油采收率的应用效果。

4 硝酸盐还原菌提高原油采收率

MEOR在稠油油藏的应用一直面临着挑战，以往文献报道的稠油MEOR，其黏度要求低于2000mPa·s，最佳为低于500mPa·s。2014年以来，卡尔加里大学的VOORDOUW教授和他的同事GASSARA等，一直致力于硝酸盐还原介导的微生物提高稠油采收率研究，取得了很大的进展,主要研究结果如表1和图1所示[33-38]。

表1 硝酸盐还原菌提高原油采收率

图1 硝酸盐还原菌提高原油采收率过程Fig.1 Process of nitrate-reducing mediated MEOR

VOORDOUW选择加拿大MHGC浅层稠油油田(原油API为16)进行NRB提高稠油采收率研究，温度20℃时黏度为3400mPa·s，远高于目前报道的MEOR稠油黏度。试验压力选择常压和高压2.72MPa;通过富集培养分离出2类NRB菌，一类是假单胞菌属，与施氏假单胞菌NBRC 12695菌株[21]的16SrRNA序列有99.0%相似性,能利用挥发性脂肪酸、苯甲酸盐、甲苯、乙苯、甲酚和萘等芳香化合物进行硝酸盐还原；另一类是陶厄氏菌属，与陶厄氏芳香菌S100的16SrRNA序列相似性为99%[22]，能利用醋酸盐、苯甲酸盐、甲苯和乙苯进行硝酸盐还原。

采用低成本的水溶性电子供体如糖蜜、葡萄糖、醋酸盐，以及较高浓度电子受体硝酸盐80mmol/L，在模拟柱中温度30℃下采稠油[34]。结果表明，激活的是以假单胞菌和陶厄氏菌为主的本源微生物，代谢水溶性碳水化合物电子供体和硝酸盐电子受体，产生N2和CO2混合气体，还可能产生有机酸和醇类、生物表面活性剂等，稠油被乳化为水包油乳状液，乳化指数E24达到60以上，残余油采收率达到14.4%～36.1%。此外，陶厄氏菌NRB还能利用比糖类电子供体更好的工业废溶剂异丙醇和丙酮，在电子受体硝酸盐存在下，在常压和高压下，提高稠油采收率18.2%[34]。

基于水溶性电子供体如碳水化合物[33,34]的MEOR的缺点是，该技术不使用油藏中可用的烃类底物，并且必须同时注入所有底物和发酵微生物。一旦所有组分混合在一起，发酵才开始，因此营养物渗透深度取决于其组成和运移特征，注营养物流速与反应半衰期之间的关系。相比之下，在烃和硝酸盐介导的MEOR中，石油烃(如甲苯)用作底物，面临稠油中轻质烃如甲苯等含量低，因此只需通过注水添加单环芳烃提高稠油中甲苯的浓度，从而提高MEOR效率[35-38]。

不添加水溶性电子供体，仅以硝酸盐和原油从该稠油地层富集本源NRB，富集的NRB主要为固氮弓菌属和陶厄氏菌属[35]，能以正庚烷和残余油为碳源和能源生长，产生气体如N2和CO2，以及生物表面活性物质，细胞吸附在残余油膜上，使残余油乳化，驱替残余油。固氮弓菌属和陶厄氏菌属NRB在以前文献中已有报道[36]，能以原油为碳源和能源，尤其是降解碳5-12短链烃和甲苯。

由于稠油中轻质烃类含量低，尤其是甲苯含量低，不利于陶厄氏菌生长，因此在NRB提高稠油采收率中时，需要补充加入甲苯。在稠油中加入甲苯，稠油黏度有所降低，增强了NRB对硝酸盐的还原作用，由此提出了一种新的硝酸盐+轻质烃MEOR技术[37]。在含有0.5倍孔隙体积剩余油的高压、水湿砂柱生物反应器中，进行了甲苯和硝酸盐介导的生物反应器(ROR)的测试。与对照生物反应器相比，在原油中添加11～12mmol/L甲苯(直接加或加入水相中)和在水相中添加80mmol/L硝酸盐可增加16.5%±4.4%的采收率。由于甲苯是一种廉价的工业化学品，因此即使在目前的低油价环境下，NRB-MEOR仍有可能成为增加原油产量的一种成本效益高的方法[37]。SURI等[38]通过高压模拟柱试验，进一步验证了硝酸盐+甲苯提高稠油采收率的效果。在11.2mmol/L甲苯和80mmol/L硝酸盐介导下，陶厄氏菌和假单胞菌在稠油模拟高压驱油试验中(温度25℃，压力2.72MPa)，硝酸盐还原率60%左右，提高稠油采收率11.2%。

疏水性电子供体中，乙苯和甲苯是硝酸盐还原的重要电子供体[39-47]，硝酸盐电子受体可能参与烷基苯底物的活化，但两者的代谢途径不同。甲苯通过富马酸加成进行厌氧代谢，而乙苯的氧化涉及乙基侧链的脱氢，醋酸盐和苯甲酸是这些代谢途径的中间产物[48]。在模拟驱油使用的批量和连续培养试验中，陶厄氏菌和假单胞菌是最主要的本源NRB类群，在反硝化条件下均能在醋酸、苯甲酸盐、乙苯和甲苯上生长。陶厄氏菌属是目前研究比较多的NRB，它还可以利用苯乙酸、吲哚、对甲酚、苯酚和其他电子供体[49-51]。β-变形杆菌Azoarcus/“Aromatoleum”/Thauera菌群含有多种能够厌氧降解芳香化合物和碳水化合物的NRB。基因组学和蛋白质组学与靶向代谢产物分析的应用已被证明有助于发现各种新的反应和途径，重建复杂的芳烃厌氧降解代谢网络，以及了解后者是如何适应环境变化的。在过去的二十年里，在3个主要的NRB有机体/方法的特定方向上取得了重大进展：

1)ThaueraaromaticaK172和AromoilumaromaticumEBN1的新型酶促反应的生物化学；

2)A.aromaticumEBN1的生理学和蛋白质基因组学；

3)Azoarcussp.菌株 CIB转录因子的分子机制[51]。

5 结论与建议

通过对近年来硝酸盐还原介导的MEOR研究进行总结和回顾，得出如下结论：

1)原位油藏环境广泛分布着本源微生物NRB，厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体，原油轻质烃作为电子供体生长，其中代表种属主要有陶厄氏菌和假单胞菌。

2)在油藏高温高压条件下，硝酸盐能诱导产生碳酸铁或碳酸钙沉淀，降低高渗透层渗透性，封堵裂缝，通过改善波及效率途径提高原油采收率。

3)在硝酸盐还原介导下，油藏本源NRB如施氏假单胞菌能产生物表面活性剂，改变岩石矿物润湿性，降低油水界面张力，乳化原油，通过改善驱油效率途径提高原油采收率。

4)稠油油藏NRB，在添加硝酸盐和水溶性碳水化合物或者油溶性单环芳香烃化合物后，能产生N2和CO2混合气体，增加地层压力，降低原油黏度，乳化原油，通过烃-硝酸盐代谢途径提高原油采收率。

尽管NRB的EOR机理比较明确，也开展了部分NRB驱油模拟试验，并取得了良好的驱油效果，但还存在一些问题亟待解决，如原位油藏NRB资源多样性，以及与其他本源菌的协同作用或竞争作用，油藏高压条件对NRB生长和代谢产生物表面活性剂的影响、原油被乳化驱动的机理、NRB驱油的分子机制等，还需要进一步研究。建议全面调查不同温度和地质条件油藏中本源NRB资源分布和多样性，加强油藏高温高压高盐等环境条件下，开展原位油藏下NRB诱导矿物沉淀和产生物表面活性剂研究，NRB驱油的二维或者三维模拟驱油试验研究，考察各种油藏环境因素和营养组分对提高原油采收率的影响，优化驱油参数；并借助CT扫描、XRD岩石矿物分析、核磁共振NMR等手段，表征岩心驱油前后孔渗和矿物组成变化，残余油分布。此外，通过色质联用仪器和傅里叶变换离子回旋共振质谱等手段，表征NRB驱油前后原油组成变化、代谢物结构特征以及对驱油效果影响，从分子水平上揭示NRB的驱油机理，为NRB提高原油采收率工业化应用提供基础数据和指导作用。