1 株H7N9 亚型禽流感病毒的遗传进化和分子特征分析

郭康康，崔 欢，张 诚，张 博，陈立功，刘聚祥，董世山

（1.河北农业大学 动物医学院, 河北 保定 071001；2. 农业部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站， 河北 保定 071001；3. 河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001）

H7N9 亚型禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）是由8 个基因片段组成的单链负股RNA 病毒［1］。根据致病性的高低，可分为高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（Low pathogenic AIV，LPAIV），血凝素（Hemagglutinin，HA）是AIV 粒子表面最丰富的蛋白， 是影响病毒致病力和宿主范围的主要因素， 可以介导病毒和宿主细胞受体的结合［2］。野禽被认为是AIV 的天然宿主，当LPAIV 由野禽传播到家禽时， 在HA 中引入多个碱性氨基酸残基发生变异， 转化为HPAIV［3］。近年来研究证明AIV 的聚合酶B2（Polymerase B2，PB2）、聚合酶B1（Polymerase B1， PB1）和聚合酶A（Polymerase A，PA）蛋白发生适应性位点突变是AIV 跨物种传播并适应新宿主的一种重要方式，其中PB2 蛋白上关键氨基酸位点突变是影响病毒致病性的重要因素，涉及到的位点如：E627K、E158G、A558V、D701N 等［4］。随着研究的深入，AIV 中越来越多的蛋白适应性位点被发现，为研究预防和治疗禽流感药物提供了技术保障。

1997 年，我国香港首次报道了H5N1 AIV 感染人的事件，随后H9N2、H7N3 等感染人的事件陆续发生［5］。2013 年，在我国上海出现首例人感染H7N9 案例，随后安徽、江苏、浙江等省份相继发生， 养禽业也发生感染H7N9 亚型禽流感案例，不仅给我国养禽业造成巨大经济损失，也对人类公共卫生安全带来前所未有的挑战［6］。人群中散发性的出现H7N9 亚型禽流感感染事件，大多具有家禽或者活禽交易市场暴露史，为H7N9 AIV 从禽类直接跨物种传染给人类提供了重要的潜在可能。

本研究通过对1 株H7N9 亚型禽流感病毒基因测序和序列分析，研究AIV 遗传进化规律，了解其内部蛋白氨基酸位点变化，为禽流感防控提供了可靠依据。

1 材料方法

1.1 主要试剂

RNA 提 取 试 剂 盒（RNeasy Micro Kit）购 自QIAGEN 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Magen 公司；反转录酶及其Buffer、dNTP、RNA 酶抑制剂、ExTaq 聚合酶及其Buffer、DL-2000 Marker 购自 TaKaRa 公司；随机引物，反转录引物，流感通用扩增引物由工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组片段的扩增 严格按照QIAGEN 公司的RNA 提取试剂盒说明提取RNA。以病毒RNA 为模板，参照宝生物相关试剂盒说明书配制体系为20 μL，反转录合成cDNA。以病毒cDNA 为模板，用流感通用引物扩增8 个基因片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司测定基因序列。

1.2.2 基因序列分析 将禽流感8 个基因片段PB1、PB2、PA、HA、NA、 非 结 构 蛋 白（Nonstructural Protein，NS）、基质蛋白（Matrix Protein， M）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）序列分别在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行核苷酸序列Blast 分析。从全球共享禽流感数据倡议组织（Global Initiative on Sharing All influenza Data， GISAID） 数 据 库下载人源H7N9 病毒HA、NA 序列。使用MEGA 6. 0 软件，进行系统进化分析。用NetNGlyc 1.0 Server 进行序列氨基酸位点分析。其中，人源流感 参 考 毒 株 为A/Wuxi/3/2013（H7N9）， ID 为EPI_ISL_153008。禽源流感参考毒株为A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）， 基 因PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M、NS 的GenBank 登录号 分 别 为KJ549783.1、KJ549784.1、KJ549785.1、K J 5 4 9 7 8 7.1、K J 5 4 9 7 8 6.1、K J 5 4 9 7 8 8.1、KJ549789.1、KJ549790.1、KJ549787.1、KJ549786.1、KJ549788.1、KJ549789.1、KJ549790.1。

2 结果与分析

2.1 禽流感病毒基因组片段的扩增

通过RT-PCR 方法扩增1 株AIV 的8 个基因片段（图1），测序得到8 个基因组序列。将序列在NCBI 上进行Blast 分析，确定为H7N9 亚型禽流感病毒并命名为A/environment/Hebei/621/2017（H7N9），简称EN621。

2.2 同源性分析

EN621 毒株8 个基因序列经NCBI 中Blast 分析，结果显示该病毒8 个基因片段均与H7N9 亚型禽流感病毒高度同源，相似度均在99% 以上（见表1）。

图1 EN621 毒株8 个基因片段的扩增结果Fig. 1 PCR products of eight genes of EN621

表1 EN621 毒株8 个基因片段核苷酸同源性分析Table 1 Nucleotide homology analysis of eight genes of EN621

2.3 HA 和NA 遗传进化分析

根据HA 和NA 遗传进化分析（见图2），其中与EN621 毒株HA 基因同源性最高的毒株是A/chicken/Henan/HNXY1/2017（H7N9），同源率为99.69%， EN621 毒株HA 基因与A/chicken/Guangdong/SD103/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/GD15/2016（H7N9）、A/chicken/Guangdong/HP001/2017（H7N9）、A/chicken/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 和A/chicken/Jiangsu/18828/2014（H7N9）等珠江三角洲地域毒株属于同一进化支进化而来。EN621 毒株HA 基因与人源流感毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）、A/Jiangsu/18828/2014（H7N9）、A/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 同 源 率 分 别 为97.12%、97.36% 和97.42%。

EN621 毒株NA 基因同源率最高的毒株是A/chicken/Guangdong/S11523/2017（H7N9），同源率为99.71%， EN621 毒株NA 基因与A/chicken/Guangdong/SD156/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD11523/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD010/2017（H7N9）、A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）等珠江三角洲地域毒株属于同一进化支进化而来。EN621 毒株NA 基因与人源流感毒株A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）、A/Jiangsu/03/2013（H7N9）、A/Nanjing/M2/2013（H7N9）同源率分别为98.38%、96.84%、97.28%、97.92%。结果显示，EN621 可能来源于珠江三角洲谱系，属于欧亚型；其HA 和NA 均与2013 年至2016 年人源H7N9 相对应片段相似度较高，推测其传播宿主由禽传播到人后再传播到禽，进一步在禽内传播。

图2 HA、NA 基因进化树Fig. 2 Evolutionary tree of HA, NA genes

2.4 HA 和NA 蛋白的相关糖基化位点分析

HA 蛋白氨基酸序列分析结果表明，共计编码564 个氨基酸， 具有5 个潜在糖基化位点，其中与人源参考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的HA 蛋白和禽源参考毒株A/chicken/Shanghai/PDCN-02/2014（H7N9）的HA 蛋白对比发现。EN621 毒株的HA 蛋白的裂解位点处有多个连续碱性氨基酸 PKRKRTARGLF，符合典型高致病性AIV 分子特征， HA 受体结合位点226 位为谷氨酰胺（Q）未发生突变，优先与禽类的特异性受体结合（见表2）。

表2 HA 蛋白糖基化位点分析Table 2 Analysis of glycosylation sites of HA proteins

NA 蛋白氨基酸序列分析结果表明，共计编码465 个氨基酸，具有6 个潜在糖基化位点，其中与人源参考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的NA 蛋白和禽源参考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）NA 蛋白对比发现，EN621 毒株NA 蛋白上与耐药性有关的关键氨基酸位点119E、152R、274H、292R、294N 未突变，不产生耐药性（见表3）。

表3 NA 蛋白糖基化位点分析Table 3 Analysis of glycosylation sites of NA proteins

2.5 内部蛋白关键氨基酸位点分析

EN621 毒株内部蛋白与人源参考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的内部蛋白和禽源参考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）内部蛋白对比发现， EN621 毒株PA 蛋白上对小鼠致病性有影响以及对细胞生长和病毒复制有关的关键氨基酸224S、615K、638R、638R 和539K 等均未突变。EN621 毒株PB2 蛋白上对病毒的复制、致病性或跨宿主传播能力等起决定性作用关键氨基酸627E、701D、714S、591Q、590G、158E 等均未突变。EN621 毒株PB1 蛋白上对影响聚合酶活性的关键氨基酸677T 和678S 未发生突变。EN621 毒株NP 蛋白上对AIV 的复制和致病性有着密切联系的关键氨基酸第184 位由A 突变为K。EN621 毒株NS1 蛋白与耐药性相关的位点92D 未发生突变。

3 讨论与结论

根据HA 和NA 基因的遗传进化树分析显示， 本研究中的H7N9 AIV 与2013 年无锡分离到的人源流感毒株相近， 推测可能为2013 年人源流感毒株与其他亚型禽流感毒株重组进化而来，在禽群中传播。近年来研究表明AIV 在家禽和野生禽类体内不断重组，使其具有高致病性和传播性的潜在可能［7-8］。M、PB1、PB2 基因与H9N2 亚型禽流感毒株相应基因片段高度同源，同时M 基因与湖北、广东、江苏等南方地区分离的H9N2 AIV 的M 基因处于同一进化支，NP 基因与H6N6，H9N2 等多个亚型禽流感毒株NP 基因高度同源，且宿主来源广泛， 地域上多为长江和珠江三角洲地区，说明EN621 毒株是家禽和野生水禽等不同宿主来源的基因重组进化而来， 珠江三角洲和长江三角洲两地域是禽流感病毒的重组和传播的重要场所，推测有可能起源于珠江三角洲［9-10］。遗传进化分析结果表明本研究毒株并未发生较大变异，当前疫苗依旧可以预防，但仍要注意生物安全，防患于未然。

已报道的研究证实，PB2 蛋白上某些氨基酸的改变是影响AIV 致病性的重要因素，如PB2 蛋白中第627 位氨基酸由E 突变为K，是最常见的哺乳动物适应性位点突变，且该位点在H10N8、H7N9、H3N2 等多种亚型AIV 中可检测到，EN621 毒株PB2 蛋白的627 位氨基酸为E 未发生突变［11-14］。近年报道H9N2 禽流感病毒的PB2 的D253N 突变， 可增强对小鼠的致病性，而EN621 毒株PB2 蛋白D253N 未突变［15-16］。EN621 毒株NP 蛋白关键氨基酸位点第184 位由A 突变为K，有报道称此位点突变与AIV 的复制和致病性有着密切联系，EN621 毒株PA 蛋白上影响聚合酶活性的510H 未突变［17］。有学者研究发现，NS1 蛋白的D92E 位点突变会造成流感病毒对人的致病性增强，也会对细胞因子如 IFN 的抗病毒耐药性产生影响但本研究中的EN621 毒株NS1 蛋白的92D 未突变［17-18］。

本研究中的H7N9 AIV 为高致病性欧亚型禽流感毒株，HA 和NA 基因片段与人源流感毒株同源性较高，NP、M、PB1 等基因与多个亚型禽流感毒株高度同源，具有感染人的潜在可能，建议加强对H7N9 AIV 的监测，并对家禽做好相应的免疫计划，建立长期有效的防控机制。