猪繁殖与呼吸综合征病毒基因测序的临床应用

张振东，王 聪，王小泉，李 豪，卞 婷，李 智，曲向阳*

(1．江苏科技大学，江苏镇江 212018；2.中牧实业股份有限公司，北京 100070；3.南京博维特健康管理有限公司，江苏南京 211800)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种以母猪的繁殖障碍及猪呼吸障碍为主要特征的病毒性疾病。PRRSV最早分离于20世纪90年代，是一种呈球形、有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子大小为60 nm～65 nm，基因组全长约15.4 kb，主要分为PRRSV 1(欧洲型)和PRRSV 2(美洲型)[1]。PRRSV具有快速变异与演化的特性，由于我国养殖密度大且生猪及其相关产业发展迅猛，频繁的国外引种、生猪调运以及PRRSV减毒活疫苗(modified live virus，MLV)的无序使用等各种问题普遍存在，PRRSV在多种筛选压力下进行着广泛的变异与演化，自然变异毒株、疫苗演化毒株及重组毒株层出不穷，给我国PRRS的防控带来了极大挑战[2-4]。基因测序是一种基因检测技术，随着二代测序技术的出现，现已广泛应用于临床医学中未知病原体的鉴定、耐药基因的检测、遗传病的早期筛查、肿瘤的早期诊断及精准治疗等各个方面[5-6]。在病毒学研究领域，基因测序主要应用于病毒基因组研究以及病毒的遗传演化规律。近年来，基因测序在PRRSV临床诊断、鉴定及防控过程中的应用逐渐增多，但根据笔者调查了解，多数从业者对PRRSV基因测序的目的与意义认识不够，甚至存在一些误区。因此，本文对PRRSV基因测序在临床中的实际应用及问题进行综述，以期为我国PRRSV的临床指导及科学防控提供参考。

1 我国PRRSV的遗传变异与演化

自PRRSV在我国出现以来，其发生了广泛的变异与演化，大量的PRRSV毒株被分离，但主要以PRRSV 2的散发与流行为主[7]。有研究对8624个PRRSV 2的ORF5基因序列进行了遗传演化分析，将PRRSV 2划分为9个谱系[8]，我国PRRSV 2的主要流行毒株为谱系1、3、5、8[2,7,9]。从发病猪场流产胎儿样本中分离到毒株CH-1a，是我国第1个PRRSV分离毒株[10]，CH-1a及其疫苗毒株CH-1R属于谱系8；1997年分离到1株与PRRSV 2原始毒株VR2332高度同源的毒株BJ-4[11]，属于谱系5，包括VR2332的疫苗毒株RespPRRS以及R98毒株。另外，以CH-1a及VR2332等为代表的nsp2区域未发生缺失的毒株在我国也常被称为“经典毒株”。2006年，我国暴发以nsp2区域存在30个氨基酸缺失为分子特征的高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)，临床上以“高热、高发病率、高致死率”为主要特征，常见参考毒株包括JXwn06、JXA1、TJ、HuN4等野毒株及JXA1疫苗毒株JXA1-P80、TJ疫苗演化毒株TJbd14-1及HuN4疫苗演化毒株HeN1201[2-3]，属于谱系8。2013年以来，NADC30-like毒株传入我国，参考毒株为NADC30及CHsx1401等[12]，属于谱系1；2017年，我国分离到NADC34-like毒株，参考毒株为NADC34及HLJDZD32-1901等[13]，属于谱系1。此外，我国华南部分地区散发流行QYYZ-like毒株[14]，常见参考毒株为QYYZ及GM2等，属于谱系3。我国PRRSV 1的案例及分离毒株鲜有报道，常见参考毒株为PRRSV 1原始毒株LV、变异株Lena及我国分离到的Amervac疫苗演化毒株GZ11-G1[15-17]。

了解我国PRRSV的发生、流行及演化，熟悉各谱系常见参考毒株，是进行PRRSV基因测序后遗传演化分析的关键和前提。

2 PRRSV基因测序的临床应用

PRRSV全长核苷酸约15.4 kb，主要包括nsp1α、nsp2等16个非结构蛋白和GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N以及GP5a等结构蛋白[18]。临床实际中，ORF7(N蛋白)、ORF5(GP5蛋白)以及nsp2常用作检测靶标。其中，N蛋白保守性较高，常用作PRRSV感染后的疫病诊断检测，不适用于遗传演化分析；nsp2是PRRSV基因组中最大的蛋白，存在不同形式的碱基插入、缺失及突变，常被用作分子流行病学调查，但其扩增效率相对较低；GP5基因序列是PRRSV谱系划分的依据，各毒株间亦存在较大的差异，因此临床实际中GP5最常被应用于PRRSV检测及测序的靶标[19]。

PRRSV基因测序的临床应用主要包括4个方面。①PRRSV的分子流行病学调查。根据我国生猪养殖结构，PRRSV的分子流行病学调查可从猪场、公司/体系、养殖小区、区域以及国家五个维度开展。一个猪场内不同猪群(比如母猪群与保育猪群)、一个公司或同一体系内、以镇或县为单位的养殖小区内、以市或省为单位的区域内以及国家水平上的PRRSV分子流行病学调查，通过对大量分离毒株及其现场表现规律的积累，对深入了解我国PRRSV的流行、发生以及防控具有重要意义。②PRRSV追溯系统的建立。PRRSV可通过猪只、精液、车辆、人员、物资、空气、疫苗等多个途径入侵猪群，PRRS暴发后，对PRRSV毒株的来源、传播及感染途径的追溯性调查对PRRSV的及时防控及决策制定具有重要的指导意义。尤其当同一个体系内的不同猪场流行毒株不一致时，往往会因为后备猪只的调入、人员的交叉、车辆的混用等途径导致发病。③“新”毒株的检测。新毒株主要指从来没有的毒株，比如美国正在流行1-4-4毒株；自然变异毒株，比如2006年暴发的自然变异的HP-PRRSV；阳性稳定猪群的异源毒株，比如MLV免疫猪场的非MLV毒株(或者称野毒株)。④后备母猪驯化毒株的确认。尤其适用血清(野毒株)进行驯化时，需要对野毒株进行基因测序，便于后续的持续跟踪监测。

3 PRRSV基因测序临床应用的误区

虽然生物安全是PRRS防控的首要原则，但在实际生产过程中，科学合理使用PRRSV减毒活疫苗(MLV)仍是较为行之有效的措施，尤其在阳性猪群引种时后备猪只入群前的免疫驯化及排毒监测等工作非常关键。我国PRRSV疫苗毒株众多，疫苗毒株如何选择？PRRSV毒株同源性越高，保护效力越好[20]，在实际生产中往往也是如此选择，但并不能以偏概全。通过比较我国PRRSV流行毒株的全长核苷酸及ORF5基因序列，结果发现，经典毒株MLV CH-1R与RespPRRS MLV全长基因组及ORF5核苷酸序列同源性分别为91.3%和91.0%，与HP-PRRSV MLV同源性分别为95.0%和95.0%；经典毒株RespPRRS MLV与HP-PRRSV MLV同源性分别为90.0%和89.0%；HP-PRRSV MLV与HP-PRRSV MLV同源性分别为99.0%和99.0%；NADC30-like与CH-1R同源性分别为85.0%和87.0%；NADC30-like与RespPRRS MLV同源性分别为85.0%和86.0%；NADC30-like与HP-PRRSV MLV同源性分别为85.0%和86.0%(不同毒株间略有差异，但不超过1%)。因此，经典毒株与HP-PRRSV毒株之间全长核苷酸的同源性差异较大，序列比对后选择同源性较高的疫苗毒株对指导生产是非常有帮助的(非重组毒株)。但同为高致病性疫苗毒株，同源性均高达99%以上，比对后选择高致病性疫苗毒株并无意义。NADC30-like毒株与现有疫苗毒株的同源性均为85%左右，所以从同源性上分析筛选针对NADC30-like毒株的疫苗毒株，同样是无意义的。此外，现场PRRS发病案例中NADC30-like及其与疫苗演化毒株的重组毒株已为主流毒株，仅检测ORF5单个片段(603 bp，全长约15 400 bp)已然不能代表分离毒株的全貌，所以仅靠ORF5序列比对同源性后选择疫苗毒株，更加不具有代表性[21]。因此，通过检测个别片段序列，比对PRRSV分离毒株与疫苗毒株序列的同源性大小，进而筛选疫苗毒株的方法是不可取的。

4 展望

近年来，我国PRRSV流行毒株复杂化程度加剧，尤其不同谱系甚至多谱系毒株之间的重组毒株逐渐增多，为更好地了解临床致病毒株的基因组序列，建议采用扩增多个片段(GP5、GP3、GP2、nsp2、nsp9等)后进行测序分析的方式，也可与科研院所合作进行PRRSV全基因组测序。此外，随着核酸测序技术的迅猛发展，二代测序尤其新兴的三代测序等高通量测序技术在临床病原检测中展示了极强的应用前景[22-23]，并已广泛应用于人类及动物重大病原体的检测及全基因组测序分析工作中[24-25]，其在PRRSV基因测序中的临床应用及价值值得进一步探索与评估。总之，基因测序在我国PRRSV的分子流行病学调查及其科学防控过程中的作用越来越重要，只有明确测序的目的与意义，不盲目测序，适时适当的科学监测，建立不同层级的PRRSV毒株及临床表征数据库，才能真正为我国PRRS的防控带来帮助。