新型异噁唑胺类除草活性分子的设计、合成 及活性研究

王彦恩，刘晓凤，王红雨，高玉洁，张金林

(1. 河北农业大学 理学院，河北 保定 071001；2. 河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001）

近年来，由于相同作用机理除草剂的长期大量使用，导致杂草抗药性迅速发展［1］，据统计至少256种杂草对不同作用靶标的除草剂产生了抗性［2］，杂草抗性导致除草剂药效降低和使用量增大，造成恶性循环，已经成为现代农业面临的主要问题之一［3-4］，有效解决杂草抗性问题是新除草剂创制亟待解决的难题之一。

目前，基于已知除草作用靶标酶进行合理设计，是新农药分子的合理设计的有效手段。但是，长期大量使用单一靶标的除草剂，必然增大杂草的抗性风险，若轮换使用靶标相似的除草剂，抗性问题会变得更严重［5-6］。因此，新除草作用靶标的发现为开发新作用机制的除草剂分子奠定了重要基础［7-8］，也将为杂草抗性治理提供有效的方法。

转酮醇酶（Transketolase）是植物体内碳代谢和卡尔文循环中的重要酶蛋白，是植物光合速率的最大限制因子［10-11］，在光合作用中发挥着重要作用。赵斌等研究证实转酮醇酶为除草活性分子α-三联噻吩的作用靶标之一，进一步明确了转酮醇酶可能是一种新的除草剂作用靶标［9］。目前玉米植物的转酮醇酶晶体结构已有报道［12］，但是，以转酮醇酶为靶标的除草剂开发还较为少见［13-14］。α-三联噻吩是其潜在的抑制剂被广泛研究，作为黄顶菊根系分泌物的分离提取产物，对马唐和狗尾草等具有较强的除草活性。因此，对α-三联噻吩进行结构改造，设计合成新型转酮醇酶抑制剂，对解决杂草抗性具有重要研究意义。

基于生物电子等排取代或活性亚结构拼接方法是新农药创制的重要方法。例如，磺酰脲类除草剂就是将磺酰胺、脲和三嗪胺三类除草剂的活性亚结构有机拼接创制而来［15-16］。杂环化合物尤其是含氮杂环化合物，具有高效、低毒、选择性好等优点［17-23］，例如，异噁唑类衍生物具有良好抗菌、杀虫、除草等生物活性［17］，商品化除草剂异噁隆对马唐和狗尾草等具有选择性除草活性。

本研究基于新靶标转酮醇酶，根据农药分子合理设计原理，对α-三联噻吩进行先导优化，将具有良好生物活性的药效团引入化合物，设计合成9个新型异噁唑胺类化合物5(a-i)，并进行除草活性测试，从而为开发基于转酮醇酶新靶标的除草剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试杂草种子为反枝苋（Amaranthus retroflexus）和马唐（Digitaria sanguinalis）均由河北农业大学植物保护学院农药系提供。

BRUKER AC-P400（400 MHz）核 磁 共 振 仪（CDCl3或DMSO-d6为 溶 剂，TMS 为 内 标）；Agilent G6300 离子阱液相质谱联用仪；X-4 精密显微熔点测定仪（北京富凯仪器有限公司），温度计未经矫正；HERAEUS（CHON, rapid） 型元素分析仪；层析用硅胶（200 ～300 目）为青岛海洋化工厂。试验过程中所用其他化学试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 目标化合物的合成

目标化合物的合成如（图1）所示，室温条件下，在水和甲醇混合溶剂中，芳（杂）环甲醛1 与盐酸羟胺发生醛胺缩合生成芳（杂）环醛肟2，然后，2与NCS 发生取代反应生成氯代芳（杂）环醛肟3，在冰浴的条件下，化合物3 与芳（杂）环基乙腈4反应生成异噁唑胺化合物5(a-i)。具体合成步骤如下：

图1 目标化合物的合成路线Fig. 1 Synthesis route of the target compounds

1.2.1 芳（杂）环醛肟2 的合成 在100 mL 圆底烧瓶中，加入15 mL 水、5 mL 甲醇、10.67 mmol芳（杂）环甲醛，室温搅拌，依次向混合溶液中缓慢加入 1.112 g 盐酸羟胺和 0.847 9 g 碳酸钠，TCL监测反应。反应结束后，用80 mL 二氯甲烷萃取，有机相用50 mL 饱和食盐水洗涤、分离有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤、脱溶，真空干燥，得到芳（杂）环醛肟2。

1.2.2 氯代芳（杂）环醛肟3 的合成 在100 mL 圆底烧瓶中，加入适量的二氯甲烷溶解5.983 mmol 芳（杂）环醛肟2，室温搅拌下，缓慢加入0.958 8 g NCS（N-氯代丁二酰亚胺），TLC 监测反应进程，约6 h 后反应结束、降温，用乙醚（50 mL×3）萃取、有机相依次用饱和食盐水和50 mL 2%的稀盐酸洗涤，分离有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤、脱溶，粗产品为氯代的芳（杂）环醛肟3。1.2.3 异噁唑胺化合物5 的合成 在100 mL 的圆底烧瓶中，依次加入3.556 mmol 氯代芳（杂）环醛肟3、5 mL 四氢呋喃、0.74 mL 三乙胺，然后在冰浴的条件下，继续加入3.556 mol 呋喃甲酰乙腈（或噻吩甲酰乙腈、2-苯并咪唑基乙腈），TLC 跟踪监测反应进程，反应约5 h，减压旋蒸溶剂，用二氯甲烷（50 mL×3）萃取、有机相用50 mL 饱和食盐水洗涤，分离有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤、脱溶，粗产品经柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯（20∶1 ～50∶1），即为异噁唑胺化合物5。

1.3 除草活性测定

采用小杯法和茎叶喷雾法测试化合物的生物活性，马唐和反枝苋为供试植株。以DMF 为溶剂，分别将目标化合物5(a-i)和丙炔氟草胺（阳性对照）配成浓度为20 g/L 的供试物储备液。取0.01 mL 的供试物储备液用灭菌水稀释至1 mL，配成浓度为200 mg/L 的待测溶液。以不含药剂的空白溶液作为空白对照。

1.3.1 采用小杯法测试化合物的除草活性 将待测的杂草种子置于25 ℃培养箱中催芽至露白，选取大小一致的种子10 颗置于装有1 层玻璃珠和1 层圆形滤纸片的小烧杯中。移取1 mL 供试物溶液或空白对照溶液缓缓加入到小烧杯中，用保湿膜覆盖小烧杯并在保湿膜上随机扎孔，以保证透气性。将小烧杯置于24 ～26 ℃的光照培养箱中培养。7 d 后，测定供试植株的根长和茎长，评价目标化合物对供试植株的抑制活性。

1.3.2 采用茎叶喷雾法测试化合物的除草活性 温室条件下，在直径为10 cm 和深度为20 cm 的塑料花盆中加入18 cm 的蛭石，从花盆底部浇水，至蛭石完全浸湿，然后在每个花盆中加入20 粒杂草种子，用蛭石覆盖杂草种子，置于人工气候箱进行培养。待杂草生长至2 ～3 片叶时，使用喷雾塔喷洒配制好的待测药剂，测试化合物为5(a-i)及商品化除草剂丙炔氟草胺，施药量为90 g/hm2。7 d 后，测定供试植株的鲜重，评价目标化合物对供试植株的抑制活性。

2 结果与分析

2.1 目标化合物结构表征

本试验基于除草剂新靶标转酮醇酶，根据农药分子合理设计原理，设计合成9 个异噁唑胺类化合物5(a-i)（表1），所有化合物均经1H NMR 和元素分析验证，其理化数据和结构表征如下：

化合物5a，淡黄色固体，产率81.5%，m.p.: 152.3 ～153.3 ℃；1HNMR(CD3Cl，400 MHz)δ7.78(s，1H)，7.37(d，J=4.0Hz，1H)，7.24(d，J=4.0 Hz，1H)，6.71 ～6.69(m，1H)，6.24(d，J=4.0 Hz，1H)，2.46(s，3H).Anal.calcd for C13H10N2O4:C60.47，H 3.90，N10.85；found C 60.44，H 3.85，N 10.81。

化 合 物5b， 黄 色 固 体， 产 率82.3%，m.p.: 129.1 ～130.1 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ 8.03(d，J=4.0 Hz，1H)，7.72(d，J=4.0Hz，1H)，7.27 (t，J =4.0 Hz，1H)，7.20 (d，J = 4.0 Hz，1H)，6.22 (d，J= 4.0 Hz，1H)，2.44 (s，3H).Anal.calcd for C13H10N2O3S：C 56.92，H 3.67，N 10.21；found C 56.89，H 3.71，N 10.23。

化 合 物5c， 白 色 固 体， 产 率77.5%，m.p.: 124.2 ～134.2 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ7.82 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.35 ～7.27(m，3H)，6.33 (d，J=4.0 Hz，1H)，6.09 (d，J=4.0 Hz，1H)，2.37 (s，3H).Anal. calcd for C15H12N4O2：C 64.28，H 4.32，N 19.99；found C 64.25.89，H 4.35，N 19.94。

化 合 物5 d， 白 色 固 体， 产 率80.5%，m.p.: 134.5 ～135.5 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ8.58(d，J=1.6 Hz，1H)，7.93 ～7.75 (m，4 H)，6.65 (d，J=4.0 Hz，1H). Anal. calcd for C12H8N2O3S: C 55.38，H 3.10，N 10.76；found C 55.35.89，H 3.09，N 10.70。

化合物5e，白色固体，产率82.5%，m.p.：129.5 ～130.5 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ8.50 (s，1H)，8.32 (d，J=4.0 Hz，1H)，7.92～7.76 (m，3H)，7.21(t，J=4.0 Hz，1H).Anal. calcd for C12H8N2O2S2：C 52.16，H 2.92，N 10.14；found C 52.15，H 2.89，N 10.16。

化 合 物5f， 白 色 固 体， 产 率76.5%，m.p.: 108.5 ～109.5 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ8.66(s， 1H )，7.77 ～7.63 (m， 4H)，7.34 ～7.31 (m，2H)，7.22 (t，J=4.0 Hz，1H ).Anal.calcd for C14H10N4OS: C 59.56，H 3.57，N 19.85；found C 59.55，H 3.59，N 19.84。

化 合 物5g， 白 色 固 体， 产 率77.1%，m.p.: 127.3 ～128.3 ℃；1H NMR (CD3Cl， 400 MHz)δ8.15 ～8.11(m， 2H)，7.75 (d，J=4.0 Hz， 1H)，7.60 (d，J=4.0 Hz，1H)，7.28 (t， J = 4.0 Hz，1H ). Anal. calcd for C11H7N3O2S2: C 47.64，H 2.54，N 15.15；found C 47.63，H 2.56，N 15.14。

化 合 物5h， 白 色 固 体， 产 率75.6%，m.p.: 119.5 ～120.5 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ8.01 ～7.78 (m，2H)，7.42 (d，J = 3.6 Hz，1H)， 7.60 ～7.59 (m， 1H)，6.72 (t，J = 2.0 Hz，1H )，4.00 (s，3H). Anal. calcd for C12H10N4O3: C 55.81，H 3.90， N 21.70；found C 55.79，H 3.93，N 21.73。

化 合 物5i， 白 色 固 体， 产 率76.1%，m.p.: 123.4 ～133.4 ℃；1H NMR(CD3Cl， 400 MHz)δ8.09 (d，J=3.2 Hz，1H)，7.77 (d，J =4.4 Hz，1H)，7.61～7.59 (m，1H)，7.30 (t，J=4.0 Hz，1H )，7.27 ～7.25 (m，1H)，4.02 (s，1H). Anal. calcd for C12H10N4O2S: C 52.54，H 3.67，N 20.43；found C 52.53，H 3.69，N 20.45。

2.2 目标化合物的除草活性测定

2.2.1 小杯测试法 评价目标化合物5(a-i)的除草活性，以商品化除草剂丙炔氟草胺为阳性对照，小杯法测试化合物除草活性结果如表1 所示，在浓度为200 mg/L 时，大部分化合物对马唐和反枝苋的根茎抑制率都大于80%，表明合成的化合物对马唐和反枝苋有较好的防治效果；其中化合物5c 和5f 对马唐和反枝苋的根茎抑制率均大于90%，其明显优于对照药剂丙炔氟草胺对马唐和反枝苋的根茎抑制作用（表1），说明5c 和5f 比对照药剂的丙炔氟草胺具有更好的防治效果，与其它化合物不同，5c 和5f 都含有苯并咪唑基团，这可能是它们具有更高除草活性原因。

表1 化合物5(a-i)的结构和除草活性（200 mg/L，小杯法，抑制率%）Table 1 Structure and herbicidal activity of compounds 5(a-i) at 200 mg/L (small cup method, inhibition rate%)

2.2.2 茎叶喷雾法测试 在温室条件下，茎叶喷雾法测试化合物5(a-i)及商品化除草剂丙炔氟草胺的苗后除草活性，施药量为90 g /hm2，测试结果如表2 所示，大部分化合物对马唐和反枝苋的鲜重抑制率大于80%，说明此类化合物具有一定的苗后除草活性；其中化合物5c 和5f 对马唐和反枝苋鲜重抑制率大于90%，其明显优于对照药剂丙炔氟草胺对马唐和反枝苋的鲜重抑制率，具有更高效除草活性，这与小杯法测试结果基本一致。此外，与小杯法测试结果不同的是，化合物5h 和5i 也具有相对较好的苗后除草活性，它们对马唐和反枝苋鲜重抑制率达到了90%左右，与其他化合物比较，5h 和5i 具有较低的疏水常数（CLogP），这可能会提高化合物的苗后除草活性。

表2 化合物5（a-i）的苗后除草活性（90 g /hm2，茎叶喷雾法，抑制率 %）Table 2 Post-emergence herbicidal activity of 5(a-i) at 90 g /hm2 (foliar spray method, inhibition rate %)

3 讨论与结论

α-三联噻吩是潜在的转酮醇酶抑制剂被广泛研究，是具有良好的除草活性的植物源除草剂［9］，另外，杂环尤其是含氮杂环类化合物具有毒性低、活性高、用量少、选择性好等特点［15-16］，是重要的农药合成中间体。例如，咪唑、异恶唑等及其衍生物，在除草、杀菌、杀虫等方面具有良好生物活性，也是新农药创制过程中常用的药效团［17-23］。本试验基于除草剂新靶标转酮醇酶，采用农药分子合理设计的原理，对α-三联噻吩进行先导优化，通过醛胺缩合、亲核取代及闭环反应合成了一系列异噁唑胺类化合物5(a-i)，由于合成氯代芳（杂）环醛肟3 的过程中，副产物丁二酰亚胺不溶解于乙醚，因此，采用乙醚萃取，可以除去副产物，便于纯化。此外，试验发现仅含有活泼α 氢的乙腈衍生物与氯代芳（杂）环醛肟反应生成异噁唑胺化合物，因此，本研究选择具有活泼α 氢的呋喃甲酰乙腈、噻吩甲酰乙腈等为原料合成目标化合物。

为了兼顾田间危害情况和生物学分类［24］，本试验选取禾本科杂草马唐和阔叶杂草反枝苋为供试植株，活性测试结果表明，含有苯并咪唑基团的化合物5c 和5f 表现出高的除草活性，对马唐和反枝苋的根茎抑制率达到90%～96%，其优于对照药剂丙炔氟草胺（80%～88%），在R2位置采用苯并咪唑基团有利于提高化合物除草活性，此外，化合物具有较低的疏水常数可能有助于提高对杂草的苗后除草活性。因此，5c 和5f 作为除草活性候选化合物，值得进一步结构优化改造。