建兰花叶病毒广东分离物TGBp1 生物信息学 分析及抗血清制备

宋若楠，饶雪琴

(广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室/华南农业大学 植物保护学院，广东 广州 510642)

兰花（Cymbidium spp.）是我国花卉产业的重要支柱，病毒病害在兰花生产中发生普遍，呈逐年加重趋势，使兰花生产受到极大影响。已报道侵染兰花的病毒有多种，建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是危害兰花生产的最重要 病 毒 之 一［1］。CymMV 属 于 马 铃 薯X 病 毒 属（Potexvirus），基因组为正单链RNA［2］，5' 端有帽子结构，3'端有poly（A），包含5 个开放阅读 框（open reading frame, ORF）［3］。ORF1 编 码依赖RNA 的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp），ORF2-4 编码重叠的三基因连锁 蛋 白（triple gene block protein, TGBp）TGBp1/TGBp2/TGBp3， 即 运 动 蛋 白（movement protein, MP）［4］，ORF5 编码衣壳蛋白（coat protein，CP）［5］。

目前，国内对CymMV 的研究集中在该病毒基因序列［6］和检测技术，如血清学、生物学、电镜观察等［7-8］，有关对CymMV 病毒蛋白和运动蛋白TGBp1 基因研究报道不多。本研究以前期构建的CymMV 广东优势病毒的全基因序列侵染性克隆为材料，构建CymMV TGBp1 原核表达载体，并制备其抗体，为进一步研究CymMV TGBp1 的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CymMV 侵染性克隆本研究室保存；新西兰大白兔购自广东省医学实验动物中心；pET-28a（+）载体为本实验室保存；大肠杆菌DH5α 菌株和Rossetta（DE3）菌株均购自上海唯地生物有限公司。

1.2 引物设计

根据已知的TGBp1 序列设计扩增全长的引物，在上下游引物引入BamH Ⅰ/Sac Ⅰ酶切位点，引物合成由北京奥科生物公司完成。引物序列为：TGBp1-F：5'-GGGATCCATGGAGCTGGCGTACT TAG-3'；TGBp1-R：5'-GGAGCTCTCAGGTGG-3'。

1.3 TGBp1 的生物信息学特性分析

利 用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）进行蛋白质结构域预测分析； 通过WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/） 和TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP1.1/index.php）进行亚细胞定位预测分析；应用TMHMM Server v2. 0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质跨膜结构域进行预测分析；通过在线工具SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）进行蛋白质的二级结构预测。

1.4 TGBp1 原核表达载体的构建

将pET-28a（+）载体用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ进行双酶切，与同样双酶切得到的目的基因进行连接，随后转化大肠杆菌DH5α 菌株，挑取菌落进行PCR和测序鉴定，以获取含目的基因的重组质粒。

1.5 重组蛋白的诱导表达和纯化

将鉴定为阳性重组质粒转化Rossetta（DE3）菌株，挑取阳性单菌落接种到含Kan 抗生素的LB 液体培养基中，37 ℃下震荡培养，直至菌液OD 值为0.6 时，然后分别加IPTG 至5 mL 诱导好的菌液中，使其终浓度为0.5、0.6、0.7 和0.8 mmol/L，诱导表达时间分别为4、5、6 和7 h，以优化诱导表达时间和IPTG 浓度。分别取不同IPTG 诱导浓度及不同诱导时间的菌液1 mL 用PBS 重悬，超声破碎，利用SDS-PAGE 对离心后的上清和沉淀分别进行重组蛋白的可溶性分析。收集诱导表达后的菌体，冰浴超声波破碎后，收集上清，按照Clontech 公司的Histag 融合蛋白纯化操作说明进行重组蛋白纯化，并进行浓度测定。

1.6 TGBp1 重组蛋白抗血清的制备及效价测定

将纯化后的重组蛋白（250 μg /mL）作为抗原制备抗血清。第1 次注射75 μg 纯化的融合蛋白到兔子耳静脉；之后取500 μg 纯化的融合蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化后作为抗原进行皮下多点注射；每7 d 免疫1 次，共免疫6 次。最后1次用250 μg纯化的融合蛋白加强注射兔子耳静脉。免疫7 d 后，耳静脉采血测定效价，效价达到要求即大量提取抗血清。注射抗原前取兔子耳静脉血血清作为阴性对照。

1.7 Western blot 分析

将变性后的重组蛋白质进行SDS-PAGE，并经以IPTG 诱导的未转化重组质粒的Rossetta（DE3）菌体裂解液和未经IPTG 诱导的转化了pET-28a（+）重组质粒的Rossetta（DE3）菌体裂解液为对照。电泳结束后，通过电转移将SDS-PAGE 胶上的蛋白转印至PVDF 膜上，以制备的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 为二抗，通过碱性磷酸酶标记的显色剂检测表达的重组蛋白。利用化学发光成像系统（美国Bio-Rad）进行观察，拍照记录结果。

1.8 抗血清的效价测定

抗原浓度稀释到5 μg /mL，纯化的蛋白做阳性对照，免疫前未稀释的兔血清做阴性对照，并设置清水为空白对照。抗血清用含0.1% 牛血清白蛋白的磷酸缓冲液进行稀释，稀释度为1∶21～1∶230，用间接ELISA法进行效价检测，具体参考邓丛良等［9］的方法。

2 结果与分析

2.1 TGBp1 生物信息学分析

利用WoLF PSORT 和TargetP1.1 Server 对TGBp1 氨基酸序列进行了定位分析，WoLF PSORT预测结果显示TGBp1 含有细胞核和细胞质定位信号，TargetP1.1 Server 预测TGBp1 可以定位在任何位置。因此，TGBp1 亚细胞定位于细胞核和细胞质。利用InterPro 和TMHMM Server2. 0 在线工具对TGBp1 氨基酸序列进行了结构域和跨膜结构域预测，结果表明，TGBp1 从第26 位氨基酸到第223位氨基酸是一个保守的解旋酶结构域，无跨膜结构域。通过在线工具SOMPA 对TGBp1 蛋白二级结构预测进行了预测，结果表明，TGBp1 二级结构中α- 螺旋占24.46%，延伸链占14.97% ；β- 转角占4.72%，无规卷曲占51.07%。

2.2 TGBp1 基因的克隆和重组原核表达pET28a-TGBp1 的鉴定

以CymMV 质粒DNA 为模板，用特异性引物TGBp1-F/TGBp1-R 进行PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳结果表明，PCR 扩增产物与预期大小一致，为702 bp（见图1）。分别将目的基因与同样用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切的载体pET-28a（+）进行连接，连接产物转化大肠杆菌，对pET28a-TGBp1重组菌落进行PCR 鉴定。电泳结果表明，菌落PCR扩增产物与预期大小一致。测序结果表明，TGBp1成功克隆到pET-28a（+）载体中。

2.3 TGBp1 基因的原核表达及表达优化

重组表达质粒pET28a-TGBp1 转化Rossetta（DE3）菌株后，菌体经超声破碎后离心，对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE 电泳，结果显示，融合蛋白主要存在于菌体沉淀物中。含pET28a-TGBp1的重组菌经不同浓度的IPTG 诱导以及不同时间的诱导表达，再进行SDS-PAGE 电泳，电泳分析表明，融合蛋白的最佳IPTG 诱导浓度为0.6 mmol/L，最佳诱导时间是5 h（见图2A、2B）。

图2 不同IPTG 浓度和不同诱导时间下His 融合蛋白表达产物的SDS-PAGE 电泳分析Fig.2 Analysis of prokaryotic expression products of His fusion protein by SDS-PAGE in different IPTG concentration and different induction time

2.4 抗血清效价测定

用纯化的融合蛋白作为抗原制备抗血清，用间接ELISA 法检测CymMV TGBp1 抗血清效价。间接ELISA 结果表明，抗血清稀释至524 288 倍时，仍然具有明显的阳性反应（图3），表明该抗血清效价可达524 288 倍。

图3 间接ELISA 测定CymMV TGBp1 多克隆抗体效价Fig. 3 Polyclonal antibody titer of CymMV TGBp1 tested by indirect ELISA

2.5 Western blot 检测

以制备的TGBp1 多克隆抗体对融合蛋白进行免疫检测，结果表明，在目的蛋白位置有明显杂交带（见图4），说明所制备的抗血清可以与诱导表达的融合蛋白His-TGBp1 发生抗原-抗体识别反应，为专化性抗血清。

图4 His-TGBp1 融合蛋白的Western blot 分析Fig.4 Analysis of fusion protein of His-TGBp1 by Western blot

3 讨论与结论

本研究分析了CymMV 广东分离物 TGBp1 的生物信息学，构建了CymMV TGBp1 基因的原核表达载体，优化了蛋白表达条件，同时制备了高效价的TGBp1 多克隆抗体，为该蛋白的功能研究奠定基础。

本实验室前期完成了CymMV 广东分离物的基因组测序［6］，但TGBp1 的功能有待进一步了解。本研究利用生物信息学软件对CymMV TGBp1进行全面分析预测，生物信息学分析结果表明，TGBp1 可定位于细胞核和细胞质，且有一个保守的解旋酶结构域，无跨膜结构域，这与Wong 等［3］和Kalinina 等［10］研究结果一致；此外，TGBp1 还包含α-螺旋和β-折叠，无规卷曲所占比例很高，可能与蛋白质的生物活性及区域功能有关［11］。

通常抗血清的抗原制备方法有2 种，利用原核表达制备的蛋白以及提纯的病毒都可以作为制备抗血清的抗原。本研究以原核表达获得融合蛋白作为抗原免疫兔子，获得了高效价的多克隆抗血清。也有学者利用提纯的病毒作为抗原，如孟春梅［12］通过提纯感病兰花上的CymMV，制备了CymMV 单克隆抗体；朱英芝等［13］通过提纯小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）的罗汉果分离物，免疫新西兰大白兔，成功制备出抗血清。与提纯病毒制备抗原相比，原核表达操作简便，不受外界环境条件限制，同时可以节省时间。

诱导条件是影响大肠杆菌外源基因高效表达的重要步骤。本研究对pET28a-TGBp1 的重组菌的诱导表达条件进行了研究，发现TGBp1 融合蛋白的最佳IPTG 诱导浓度为0.6 mmol/L，最佳诱导时间是5 h，然而外源基因的表达效率通常受大肠杆菌表达菌株、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌液浓度等因素的影响［14］，即使是同一种外源基因在不同的诱导表达试验中，由于表达菌株不同，诱导表达条件也不相同［15］。本研究所制备的高效价血清为进一步研究TGBp1 功能奠定了良好基础。