静电纺有序rGO／PLCL 支架对hiPSC-CPC 心肌分化影响的初步研究

谭瑶 颜冰倩 艾雪峰 宫艺其 王会景 陈颖 刘明璐 徐徐 王伟 付炜

心血管疾病是目前威胁人类生命健康的主要疾病之一［1］。心肌细胞不具有再生能力，由于各种原因导致的死亡的心肌细胞将由瘢痕组织代替，失去正常的生理功能，最终导致心功能衰竭。对受损的心肌进行细胞治疗是目前研究的热点。

干细胞来源广泛，避免了利用成熟心肌细胞治疗的来源和伦理问题，成为细胞治疗的重要来源。人诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cell，hiPSC）是指将体细胞重编程为多能干细胞，来源广，可实现个体化治疗以避免不良免疫反应［2-3］。目前已经有较为成熟的分化体系，可将iPSC 诱导分化形成心肌细胞［4］。研究发现，在iPSC 心肌分化过程中，细胞转化为高表达ISL1 的心肌前体细胞（Cardiac precursor cell，CPC）。这些ISL1＋CPC 能产生心脏主要的细胞群，包括心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等，研究认为ISL1＋CPC 更适合作为心脏再生的细胞［5］。然而，目前iPSCs 衍生的心肌细胞较成人心肌细胞仍在形态和功能上具有较大差异［6］。

石墨烯及其衍生物因具有无可比拟的力学特性、优异的导电性，表面积体积比大，能够进行化学修饰，成为近年来的研究焦点，并被广泛应用［7］。还原氧化石墨烯（Reduction of graphene oxide，rGO）是氧化石墨烯的还原形式，氧化基团的去除使其导电性优于氧化石墨烯；同时，还原氧化石墨烯拥有良好的生物相容性和低毒性［8］，有利于细胞黏附、增殖和分化［9］，使其成为组织工程一种良好的导电材料；此外，还原氧化石墨烯具有明显的抗氧化作用［10］，能有效清除心肌损伤产生的活性氧。研究证明，rGO 具有明显的抗菌作用，有利于减少手术后抗生素的使用［11］。这些良好的特性使其在神经［12-13］、皮肤［14］、骨［15］、肌肉［16］等领域被广泛应用。在心脏方面，Lee 等［17-18］在新生大鼠心脏注射含有rGO 的混合水凝胶，证明了rGO 作为一种导电材料可以促进心肌细胞成熟。Stone 等［19］的研究证明了含有rGO 的聚酯酰胺能够促进间充质干细胞向心肌细胞分化。

静电纺丝技术是利用聚合物溶液或熔体在强电场中喷射纺丝，通过调节纺丝条件，结合不同的材料，制备出不同需求的静电纺丝支架的一种技术，其制造设备简单、成本低、可纺材料种类繁多、工艺可控等优点使之成为制备组织工程支架的重要手段之一［20］。特定排列的纤维丝对组织细胞排列具有一定的接触导向作用［21］。心脏组织中特定的细胞排列方式有利于肌肉收缩以及同步电传导［22］。研究已证明，静电纺丝技术获得的聚丙交酯-共-ε-己内酯（PLCL）具有平行结构的纳米纤维，联合成纤维细胞共培养能够促进新生大鼠心肌细胞的成熟［23］。

本实验通过静电纺丝技术制备含有rGO 的有序PLCL 组织工程支架，对其表面结构、理化性质进行表征，并初步探索其对hiPSC-CPC 增殖、形态以及心肌分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

hiPSC 取自上海儿童医学中心李彦欣教授课题组，为脐带血细胞来源hiPSC。脐带血捐献者签署了相关知情同意书。本研究经上海儿童医学中心伦理委员会审查批准。

相关设备：研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、泰斯曼高压电源（大连泰思曼科技有限公司）、扫描电子显微镜（泰思肯有限公司）、X 射线衍射仪器（Brukeur 公司，德国）、倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）、台式单轴拉伸试验机（Instron 公司，美国）、XRD 衍射仪（Bruker 公司，美国）、绝缘导电静电材料表面电阻测试仪（苏州精格电子有限公司）、细胞培养箱（Thermo 公司，美国）、激光共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）、流式细胞分析仪（Beckman公司，美国）、酶标仪（Thermo 公司，美国）、实时定量PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。

相关试剂：rGO（昂星新型碳材料常州有限公司）、PLCL（济南岱罡生物科技有限公司）、六氟异丙醇（百灵威科技有限公司）、TeSR-E8 培养基（Stemcell 公司，加拿大）、EDTA（Thermo 公司，美国）、Y-27632（Stemcell 公司，加拿大）、基质胶（Corning 公司，美国）、PBS 缓冲液体（Hyclone 公司，美国）、Accutase 消化酶（Stemcell 公司，加拿大）、RPMI1640（Thermo 公司，美国）、减胰岛素B27添加剂（Thermo 公司，美国）、CHIR99021（Stemcell公司，加拿大）、IWP-2（Stemcell 公司，加拿大）、B27添加剂（Stemcell 公司，加拿大）、心肌细胞消化液（北京赛贝生物技术公司）、Foxp3／转录因子染色缓冲液组（Invitrogen 公司，美国）、ISL1 抗体（DSHB 公司，美国）、肌钙蛋白cTNT 抗体（Proteintech 公司，美国）、α-辅肌动蛋白α-Actinin 抗体（Sigma-Aldrich公司，美国）、TRIZOL（Thermo 公司，美国）、CCK-8 增殖试剂盒（碧云天生物有限公司）、纳米分光光度计（Thermo 公司，美国）、QuantiNova ® SYBR ® Green PCR 试剂盒（QIAGEN 公司，德国）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 材料制备与保存

PLCL 支架：PLCL 溶于六氟异丙醇，利用磁力搅拌器搅拌48 h，制备质量体积比为7%的PLCL溶液。

rGO／PLCL 支架：rGO 是经过化学还原的科研级别的化学还原氧化石墨烯。以六氟异丙醇作为溶剂，利用研磨仪60 Hz 分散rGO 制备成rGO 溶液。PLCL 溶于六氟异丙醇，利用磁力搅拌器搅拌48 h后，加入预配的rGO 溶液，配制成混合溶液：rGO／PLCL 质量比为2%，PLCL 溶液质量体积比为7%。

利用自制接收器通过静电纺丝技术纺制有序静电纺支架。纺丝电压为10～11 kV，注射器容积为10 mL，待纺丝溶液5 mL，注射器推进速度为1.5 mL／h，注射器与接收器之间的距离为8.5 cm，圆筒接收器转速1 000 r／min，接收器表面覆盖一层200 目的铁丝网，纺丝湿度维持在30%～40%，温度维持在25～30 ℃。所制备的材料保存于真空干燥箱中。

1.3 扫描电镜检测

将充分干燥的支架材料从真空干燥箱中取出，表面喷金后扫描电镜观察支架微观结构和表面形貌，最后利用Image J 软件随机选取200 个数据点统计分析纤维的角度分布，绘制纤维角度分布图；同时测量支架纤维直径，并绘制材料直径分布图。

1.4 机械性能检测

将两组支架材料放入真空干燥箱中1 周，待充分干燥后，切割成30 mm×10 mm 的矩形，支架材料厚度为0.3～0.4 mm，使用台式单轴拉伸试验机检测支架力学性能。将材料固定于仪器上，以10 mm／min的速度记录下应力-应变曲线，利用应力-应变曲线确定杨氏模量、断裂点应力和应变极限值。将材料用蒸馏水充分浸泡后重复上述实验。每组测试3 个样本。

1.5 成分检测

通过X 射线衍射仪对材料进行成分检测。X射线衍射仪装有0～115 °的CuKα 辐射源（λ ＝1.788 970 nm），用于监测晶体状态的变化。XRD工作参数：电压40 kV，电流30 mA，步长0.02 °。

1.6 导电性能检测

将材料切割成40 mm×40 mm 的矩形，真空干燥后，通过绝缘导电静电材料表面电阻测试仪采用四探针法测定支架的电阻率，修正系数为23.76。

1.7 hiPSC 培养及鉴定［24］

将融合度达到80%～90% 的 hiPSC 用0.5 mmol／L的EDTA 消化5 min，2 00×g离心5 min后，用含有5 μmol／L Y-27632 的TeSR-E8 培养基按照1 ∶6～1 ∶8重悬并接种到6 孔板中（6 孔板事先用1 ∶70 稀释的基质胶室温放置30 min 铺板），于37 ℃、5% CO2培养箱中维持培养，每天更换TeSRE8 培养基，倒置相差显微镜观察。

将完全贴壁的hiPSC 室温下以4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室温破膜30 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，添加所需的一抗Nanong／Sox2／Oct4／TRA-1-60（1 ∶200），4 ℃孵育过夜。PBS 清洗3 遍后，添加相应荧光二抗（1 ∶1 000）室温避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室温核染5 min，激光共聚焦显微镜观察。

1.8 hiPSC 心肌分化及鉴定［24］

分化前，将490 mL RPMI1640 和10 mL 减胰岛素的B27 补充物（50×）混合，制备分化培养基Ⅰ；将490 mL RPMI1640 和10 mL B27 补充物（50×）混合，制备分化培养基Ⅱ。待6 孔板中hiPSC 融合度达到80%～90%时，用Accutase 消化酶消化，200×g离心后，按12 孔板每孔1×106个hiPSC 重新种植，并在37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养48 h 至细胞铺满皿 底，将 TeSR -E8 换 成 添 加 12 μmol／L CHIR99021 的分化培养基Ⅰ，36 h 后，更换为分化培养基Ⅰ，1 d 后更换为含有5 μmol／L IWP-2 的分化培养基Ⅰ，分化第5 天更换为分化培养基Ⅰ。将分化至第6 天的细胞进行心脏前体细胞ISL1 免疫荧光和流式细胞技术鉴定。自第7 天开始，更换为分化培养基Ⅱ，每2 天更换一次新培养基。第10 天以后，可以在平板上观察到跳动的心肌细胞。

将分化至第6 天的hiPSC-CPC 用Accutase 消化酶消化15 min 后，按1×105个／孔的细胞密度接种于预先铺好基质胶的24 孔板玻璃爬片上。待贴附完全后，室温下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室温破膜30 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，添加心脏前体细胞标志物ISL1 抗体（1 ∶200），4 ℃孵育过夜。PBS 清洗3 遍后，添加相应荧光二抗（1 ∶1 000）室温避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室温核染5 min，激光共聚焦显微镜观察。

将分化至第6 天的 hiPSC -CPC 细胞用Accutase 消化酶消化15 min 后，添加 Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min进行固定破膜，添加心脏前体细胞标志物ISL1 抗体冰上孵育30 min，添加相应的荧光二抗（1 ∶1 000）冰上孵育30 min。流式细胞分析仪进行测定分析。

将分化的心肌细胞用心肌细胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌细胞消化液Ⅱ消化20 min 后，按1×105个／孔的细胞密度接种于预先铺好基质胶的24 孔板玻璃爬片上。待贴附完全后，室温下4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室温破膜30 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，添加心肌细胞标志物cTNT 抗体（1 ∶200），4 ℃孵育过夜。PBS 清洗3遍后，添加相应荧光二抗（1 ∶1 000）室温避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室温核染5 min，激光共聚焦显微镜观察。

将分化的心肌细胞用心肌细胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌细胞消化液Ⅱ消化20 min 后，添加Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min 进行固定破膜，添加带有荧光标记的心肌细胞标志物cTNT 抗体冰上孵育30 min。利用流式细胞分析仪进行测定分析。

1.9 rGO／PLCL 有序支架对hiPSC-CPC 分化心肌细胞形态的影响

将支架材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀释的基质胶中室温浸泡30 min 铺胶备用。将分化第6 天的细胞种植在铺好胶的有序支架上，继续培养至出现跳动心肌，室温下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室温破膜30 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，分别添加心肌细胞标志物cTNT、肌动蛋白α-Actin 抗体、4 ℃孵育过夜。PBS 清洗3 遍后，添加相应荧光二抗（1 ∶1 000）室温避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室温核染5 min，激光共聚焦显微镜观察。用Image J 随机取500 个统计点统计细胞的排列角度。用Image J 统计3 张不同视野的免疫荧光图并计算短棒状细胞占所有心肌细胞的比例。

1.10 rGO／PLCL 有序支架对hiPSC-CPC 分化心肌细胞增殖影响

将材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀释的基质胶中室温浸泡30 min 铺胶备用。将分化第6 天的hiPSC-CPC 种植在铺好胶的有序支架上，分别在接种后第1、4、7 天利用CCK-8 试剂盒对细胞的增殖情况进行测定。每组3 个重复样本。

1.11 实时荧光定量PCR 检测

应用反转录聚合酶链反应检测心肌相关基因的表达。收集支架上的分化至第15 天的心肌细胞，加入Trizol 提取总RNA。RNA 的浓度和纯度通过纳米分光光度计进行验证。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将RNA 反转录成cDNA。采用QuantiNova ®SYBR® Green PCR 试剂盒在实时定量PCR 仪上扩增和检测。每组3 个样本，每个样本3 个重复加样检测，收集每个样本3 个重复的平均循环阈值（Ct）值，以内源性对照18S 标准化检测结果，依据2-△△Ct计算RNA 相对表达量（表1）。

1.12 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析，数据以¯x±s表示，组间比较采用非配对t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

表1 荧光定量PCR 引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequences

2 结果

2.1 电纺膜制备及表面形态

在静电纺丝接收器上覆盖一层200 目的铁丝网，将配制的聚合物溶液通过高压喷射在接收器上形成有序支架。用于静电纺丝的PLCL 溶液呈均匀无色透明，添加rGO 的溶液呈黑色均质状。纺制形成的含rGO／PLCL 支架呈灰色，未添加rGO 的PLCL支架呈白色。扫描电镜下两组支架材料整体呈现疏松多孔结构，纤维细丝光滑笔直，排列有序，PLCL支架纤维分布在0.6～2.7 μm，80%的纤维分布在1.5～2.1 μm，rGO／PLCL 支架纤维分布在0.3～2.1 μm，80%的纤维分布在0.9～1.5 μm。PLCL 支架和rGO／PLCL 支架纤维角度分布在10 °以内者分别占54%和58%，两种材料纤维均有90%分布在40 °以内（图1）。

图1 电纺膜制备及表面形态Fig.1 Preparation and surface morphology of electrospun scaffolds

2.2 静电纺丝支架材料鉴定

两组支架在干燥情况下，根据拉伸试验数据绘制应力-应变曲线，曲线均近似正比关系，达到最大形变后发生断裂。杨氏模量分别为（2.82±0.10）MPa 和（0.49±0.03）MPa，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）；最大应变分别为280.10%±6.80%和462.70%±46.04%，差异具有统计学意义（P＜0.01）；最大应力分别为（7.89±0.10）MPa 和（2.31±0.01）MPa，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）。两组支架在湿润情况下，杨氏模量分别为（2.20±0.03）MPa 和（0.63±0.05）MPa，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）；最大应变分别为318.70%±17.53%和384.3%±24.34%，差异具有统计学意义（P＜0.05）；最大应力分别为（6.67±0.15）MPa 和（2.42±0.33）MPa，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）。利用XRD 对PLCL 支架、rGO／PLCL 支架、rGO（未进行静电纺丝）进行成分检测。PLCL 和rGO／PLCL 支架在16.5 °显示出PLCL 的特征峰，rGO／PLCL 支架特征峰的峰高度大于PLCL 支架。未进行静电纺丝的单纯rGO 在23 °显示出rGO 的特征峰。对材料的电阻率进行测定，PLCL 支架电阻率达到400 GΩ，而rGO／PLCL 支架电阻率仅为0.075 GΩ（图2）。

图2 PLCL、rGO／PLCL 支架材料鉴定Fig.2 Identification of PLCL scaffolds and rGO／PLCL scaffolds

2.3 hiPSC 鉴定

hiPSC 呈克隆样生长，细胞排列紧密，边缘清晰光滑，细胞较小，圆形，核质比高，细胞核显著。免疫荧光鉴定可以观察到高表达多能性标志物Oct4、TRA-1-60、Sox2、Nanong（图3）。

2.4 hiPSC 心肌分化及鉴定

通过添加CH99021 和IWP-2 诱导iPSC 向心肌细胞分化，分化过程中细胞发生形态变化，iPSC逐渐变为松散椭圆形的心肌前体细胞，随着分化的进行，细胞逐渐变成多形性的心肌细胞形态，在第6天细胞高表达心脏前体细胞标志物ISL1，阳性率为74.7%；并在第10 天开始出现散在自发搏动点并逐渐连成整层细胞片跳动。分化到第30 天，细胞形态清晰，呈多形性，具有明显的肌节结构，双核心肌细胞较多，高表达心肌细胞标志物cTNT，阳性率为72.3%（图4）。

2.5 rGO／PLCL 对hiPSC-CPC 心肌分化的影响

图3 iPSC 细胞特异性标志物鉴定Fig.3 Pluripotency identification of hiPSC

如图5 所示，将hiPSC 分化的心脏前体细胞重新接种到PLCL、rGO／PLCL 支架上，继续培养至第15 天，免疫荧光鉴定结果提示两组支架材料上的细胞高表达心肌细胞标志物α-Actin、cTNT，细胞排列方向与支架纤维排列方向具有一致性。对细胞长轴与支架纤维长轴形成的夹角进行统计，两组支架上均有90%以上的细胞在30 °以内，10 °范围内的细胞分别为69%和68%。心肌细胞能够被有序支架引导。对分化的短棒状的心肌细胞进行统计，rGO／PLCL 约有45%的细胞呈现短棒状形态，显著高于PLCL 组的20.1%，差异具有统计学意义（P＜0.05），更趋近于成熟细胞棒状的形态。CCK8 增殖实验提示PLCL 和rGO／PLCL 支架材料上的CPC 在接种后7 d 内均有增殖能力，分化前期rGO／PLCL 上细胞增殖效率稍高于PLCL 组，后期rGO／PLCL 上细胞增殖效率稍低于PLCL 组，但两组的增殖差异无统计学意义（P＞0.05）。qPCR 结果提示，rGO／PLC 组中与肌节成熟相关基因CTNT、MYH7／MYH6 的表达高于PLCL 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与细胞间通信相关的连接蛋白CX43 的表达高于PLCL 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 iPSC 细胞心肌分化及鉴定Fig.4 Identification of iPSC cells and myocardial differentiation

2.6 rGO／PLCL 对hiPSC-CPC 心肌分化基因水平上的影响

对CPC 细胞、两组支架材料上的心肌细胞进行RNA-seq 分析。主成分分析提示，CPC 细胞和支架材料上心肌细胞分群明显，而PLCL 和rGO／PLCL支架材料上心肌细胞差异较小。差异基因统计分析显示，CPC 分化至心肌细胞，基因发生显著变化；PLCL 支架材料与rGO／PLCL 支架材料上的心肌细胞之间差异较小，差异基因主要为下调基因。对这些差异基因进行聚类分析，在细胞成分层面，靶基因主要富集于细胞外空间和细胞外区域等GO 条目中；在分子功能层面，靶基因主要富集于钙离子结合和细胞外基质组成等GO 条目中；在生物过程层面，靶基因主要富集于细胞黏附和细胞外基质排列等GO 条目中（图6）。

3 讨论

细胞治疗为心肌损伤提供了新的治疗方案。心脏祖细胞作为种子细胞具有巨大的治疗潜力。hiPSC 来源的心脏祖细胞由于来源广泛，避免了伦理问题，成为了心肌损伤细胞治疗的理想种子细胞来源。干细胞分化来源的心肌细胞较成人心肌细胞在形态和功能上仍具有较大差异。目前的许多研究致力于利用模拟天然心脏环境的生物材料使干细胞具有更好的应用潜能［25］。

图5 有序rGO／PLCL 支架材料对iPSC-CPC 心肌分化的影响Fig.5 Effect of aligned rGO／PLCL scaffolds on differentiation of iPSC-CPC

本实验利用静电纺丝技术制备出有序rGO／PLCL 支架，有序的表面结构引导细胞排列，模拟正常心肌组织中心肌细胞的排列方式；工程化支架为贴附其上的心肌细胞提供了更接近于生理组织的机械支撑；导电材料rGO 的添加为种植于其上的细胞提供了更理想的分化环境。

图6 rGO／PLCL、PLCL 支架上心肌细胞的RNA-seq 分析Fig.6 RNA-seq analysis of cardiomyocytes on RGO／PLCL and PLCL scaffolds

利用静电纺丝技术纺制出的rGO／PLCL 支架纤维排列具有一致性，种植于其上的hiPSC-CPC 分化形成的心肌细胞在纤维上排列有序，有明显导向作用。Nunes 等［26］认为有序排列的细胞有利于心肌细胞间电传导，促进心肌细胞的同步收缩。在材料的纺制中，rGO 的添加使支架纤维直径显著降低。Ramazani 等［27］认为这是由于射流中积聚的电荷的强烈排斥作用在rGO 表面产生了大量的负电荷，从而使停留在接收器上的纤维丝具有更小的直径。以往的研究认为，这种更细的纤维丝基底能够通过增加孔隙率促进细胞的生长黏附［28］。同时，rGO 的添加增加了支架材料的应变能力，最大可扩增至462%，有利于心肌组织更好的收缩舒张。添加rGO 后，支架的弹性模量下降至（0.49±0.03）MPa（干燥）和（0.63±0.05）MPa（湿润）。而心肌的刚度在舒张开始时为10～20 kPa，在舒张末期为200～500 kPa［29-30］，刚度在数十千帕到大约1 兆帕的材料是心脏应用的最佳选择［31］。rGO 的加入使支架接近于正常心肌的力学性能，为心肌分化提供了更接近于生理组织的机械支撑。此外，导电性能测定结果提示，rGO 的添加极大降低了支架的电阻率，为hiPSC-CPC 心肌分化提供了更加良好的电生理环境，为心肌细胞之间同步电传导和肌肉收缩提供了更有利的环境，有助于心肌分化［19］。通 过 在rGO／PLCL支架上接种hiPSCCPC，发现诱导形成的心肌细胞中有更多的细胞趋近于成熟细胞短棒状的形态；同时，心肌细胞肌节相关标志物CTNT、MYH7／MYH6 的表达升高提示rGO 的添加有助于肌节的发育；此外，rGO／PLCL 支架上连接蛋白CX43 也呈现更高的表达，CX43 通常在心脏相邻心肌细胞间盘处观察到，它们促进电流流动，协调心肌细胞收缩以维持其泵功能［32］，它的升高提示rGO 有助于细胞间的通信和连接。但这些基因在整个RNA-seq 分析中变化差异较小，rGO 的添加仅仅促使小部分基因发生显著变化。综上，通过改变电生理环境在一定程度上促进了hiPSC-CPC 细胞分化成熟，如果能结合一定的电刺激，使支架材料提供的电生理环境发挥更显著的作用，可进一步调节细胞的活动，促进细胞进一步分化成熟。